|
|
Жизнь |
|
|
|
| ||||
1.6. Клеточно-опосредованная доставка терапевтических генов при травме спинного мозга (генно-клеточная терапия)Трансплантация стволовых клеток может быть направлена как на замещение погибших клеток, так и на предотвращение дальнейшей гибели выживших клеток за счёт секретируемых биологически активных молекул. Усиление же цитопротекторного действия трансплантируемых клеток при помощи генетической модификации является перспективным подходом в клеточной терапии, так как, во-первых, становится возможной адресная доставка нейропротекторных факторов (миграция трансплантированных клеток в места дегенерации) и, во-вторых, появляется возможность регулировать уровень секреции терапевтических молекул. Для генетической модификации трансплантируемых клеток в настоящее время существует два подхода: вирусный и невирусный. Невирусный (доставка в клетку плазмидной ДНК) наиболее безопасен, но не достигает, как правило, высокой эффективности трансфекции и длительности экспрессии трансгена. Повышение эффективности трансфекции клеток in vitro проводят физическими (путём электропарации) или химическими методами (с помощью катионоактивных липидов) (Cotrim et al. 2008). К общепринятым вирусным векторам в исследованиях по генной терапии относятся вирус лейкемии мышей Молони (MoMLV), аденовирус серотипа-5 (Ad5), адено-ассоциированный вирус (AAV) и лентивирусы (HIV- 1 и др.). По своей эффективности вирусные векторы превосходят плазмидные, но для некоторых из них обнаружены проблемы безопасности применения, связанные, во-первых, с риском инсерционного мутагенеза, вызываемого итеграцией ретровирусного генома в геном реципиента и, во- вторых, индуцированием потенциального иммунного ответа к векторным вирусным антигенам (Ипатов и др. 2010). Тем не менее, поиски в этом направлении продолжаются. На модели бокового амиотрофического склероза у трансгенных по SOD1-G93A мышей проведена трансплантация мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, генетически модифицированных экспрессионными аденовирусными векторами, кодирующими сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и репортерный зеленый флуоресцентный белок (EGFP). Результаты показали, что генетически модифицированные мононуклеарные клетки пуповинной крови способны проникать через гематоэнцефалический барьер, мигрировать в область дегенерации нервной ткани и сохранять жизнеспособность от момента трансплантации до смерти животных в терминальной стадии заболевания. При этом экспрессионный вектор на основе аденовируса, содержащего терапевтический ген, активно функционирует в трансплантированных клетках, а секреторный продукт рекомбинантного гена воздействует на клетки-мишени по паракринному механизму (Мухамедшина и др. 2012). Если мезенхимные стволовые клетки при трансплантации в спинной мозг слабо сдерживают процесс образования патологических полостей, то при трансплантации тех же клеток, но трансдуцированных аденовирусным вектором с геном NT-3, этот показатель значительно улучшался, что сопровождалось более выраженной регенерацией аксонов и восстановлением двигательной функции (Zhang et al., 2010). На модели дорсальной гемисекции спинного мозга у крысы при введении через 3 месяца после травмы в патологическую полость и в непосредственной близости от нее генетически модифицированных по гену NT-3 фибробластов к концу 6-го месяца показаны значительный рост аксонов кортикоспинального тракта на расстояние до 15 мм и улучшение восстановления двигательной функции (Tuszynski et al. 2003). Основываясь на данных о том, что фактор роста печени (HGF) практически полностью блокирует in vitro секрецию реактивными астроцитами TGFpi и TGFP2, была осуществлена доставка гена этого фактора в область гемисекции спинного мозга в составе трансплантируемых в эту область мезенхимных стволовых клеток (Jeong et al. 2012). На фоне значительного снижения экспрессии изоформ TGFP показано снижение активности астроцитов, что сопровождалось существенным уменьшением содержания нейрокана и отложения гликозаминокликанов в области повреждения. При этом в пределах глиального барьера выявлены усиление роста аксонов и улучшение восстановления функции. Мононуклеарные клетки крови пуповины, трансфецированные двухкассетными плазмидными векторами pBud-VEGF-L1CAM, после ретроорбитального введения мигрировали в спинной мозг мышей G93A и, как было показано при помощи иммунофлуоресцентного анализа, также экспрессировали маркёры эндотелиальных клеток и клеток микроглии (Ризванов и др. 2010). Более поздние эксперименты указывают на возможную дифференцировку генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови, трансфецированных двухкассетными плазмидными векторами pBud-VEGF-FGF2, в S100+-клетки при амиотрофическом склерозе (Rizvanov et al. 2011). Полученные в работе результаты по трансплантации генетически модифицированных монононуклеарных клеток из пуповинной крови мышам SOD1-G93A свидетельствуют о том, что трансплантированные клетки (в зависимости от типа экспрессионного вектора в спинном мозге мышей) могут дифференцироваться в макрофаги, эндотелиальные клетки или астроциты. Неоднократно предпринимавшиеся попытки одновременного применения различных стимулирующих факторов дали обнадеживающий результат. Например, в эксперименте на крысах с перерезкой седалищного нерва локальная инъекция фактора роста нервов (NGF), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) и глиального нейротрофического фактора (GDNF) по отдельности и в различных сочетаниях выявила преимущественные терапевтические мишени каждого из них. Так, NGF и GDNF существенно улучшали выживание сенсорных и мотонейронов, соответственно. CNTF оказывал определяющее влияние на развитие перикарионов, а GDNF - на отрастание нейритов и удлинение сенсорных и мотонейронов. Авторы заключают, что совместное применение всех трех факторов показало оптимальный результат в отношении восстановления функций седалищного нерва (Chen et al. 2010). Указанное обстоятельство привело к появлению генно-клеточных конструкций, одновременно экспрессирующих два и более гена, ответственных за различные стороны нейрорегенеративного процесса, которые, по мнению авторов, наиболее критичны для успеха терапии (Pereira et al. 2013). Недавно было установлено, что генетически модифицированные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки человека, одновременно сверхэкспрессирующие гены gdnf и vegf, при внутримышечной инъекции крысам с моделью БАС проявляют выраженный синергетический эффект, поддерживают структуру нервно-мышечного синапса и продлевают жизнь животных (Krakora et al. 2013). Таким образом, трансплантация генетически-модифицированных клеток при травме спинного мозга поддерживает функциональную пластичность ткани и ее способность к регенерации. Этот подход обеспечивает доставку клеткам реципиента в области повреждения нейротрофических факторов, что снижает выраженность ретроградной дегенерации аксонов, поддерживает реконструкцию ткани, включая ремиелинизацию, удлинение и коллатеральное ветвление аксонов и образование синапсов. Назад | Оглавление | Вперед Дата публикации (обновления): 11 февраля 2017 г. 13:47 . |
|
|
