3.5. Эффективность посттравматической регенерации при прямой генной терапии аденовирусом AdV-GDNF

Трансфекционная активность

Контрольные эксперименты с введением аденовируса, несущего ген зеленого флуоресцентного белка (EGFP), показали высокую трансфекционную активность вирусного носителя. Как в ростральном, так и в каудальном направлениях вблизи эпицентра травмы (на удалении 1-3 мм) зарегистрировано интенсивное свечение, свидетельствующее о том, что произошло внедрение генетического материала в клетки спинного мозга и его экспрессия (Рис. 87, 88, 89, 90). В ростральном направлении свечение было прослежено вплоть до 21 суток после травмы. Характер распределения по поперечному срезу спинного мозга и интенсивность свечения изменялись от времени. В первую неделю после травмы трансфицированные клетки спинного мозга образовывали плотные скопления в белом веществе вблизи границы серого и белого вещества. К исходу третьей недели распределение светящихся клеток становилось более диффузным, а свечение ослабевало, отражая прогрессирующее разрушение ткани спинного мозга.

Рис. 87. Свечение зеленого флюоресцентного белка на 2-е сутки после КТСМ и введения в зону травмы Ad-EGFP (контроль) на расстоянии 0,1 -0,2 см в каудальном направлении от эпицентра травмы. Синим цветом - DAPI, зеленым - EGFP. Конфокальная микроскопия. Увеличение 10х10

Рис. 88. Свечение зеленого флюоресцентного белка на 4-е сутки после КТСМ и введения в зону травмы Ad-EGFP (контроль) на расстоянии 0,2-0,3 см в каудальном направлении от эпицентра травмы. Синим цветом - DAPI, зеленым - EGFP. Конфокальная микроскопия. Увеличение 10х10

Рис. 89. Свечение зеленого флюоресцентного белка на 6-е сутки после КТСМ и введения в зону травмы Ad-EGFP (контроль) на расстоянии 0,1-0,2 см в ростральном направлении от эпицентра травмы. Синим цветом - DAPI, зеленым - EGFP. Конфокальная микроскопия. Увеличение 10х10

Рис. 90. Свечение зеленого флюоресцентного белка на 21 -е сутки после КТСМ и введения в зону травмы Ad-EGFP (контроль) на расстоянии 0,1-0,2 см в ростральном направлении от эпицентра травмы. Синим цветом - DAPI, зеленым - EGFP. Конфокальная микроскопия. Увеличение 10х10

Восстановление функции

У крыс контрольной группы (AdV-EGFP) происходило постепенное частичное восстановление произвольных движений с 3 баллов на 7-е сутки после КТСМ до 9 баллов на 30-е сутки (Рис. 91). Эти контрольные значения достоверно ниже опытных на всех сроках тестирования (р<0,05). У животных опытной группы (AdV-GDNF) показатель восстановления двигательной активности к моменту первой регистрации на 7-е сутки после травмы уже имеет довольно высокое значение 9 баллов и в дальнейшем увеличивается линейно с небольшой скоростью, характерной для второй фазы, то есть вся фаза быстрого роста в этом эксперименте начинается и завершается в более ранние сроки.

Рис. 91. Результаты теста «ВВВ» при введении AdV-GDNF. По оси ординат - баллы, по оси абсцисс - сутки после КТСМ. Черные квадратики - опыт, белые кружочки - контроль (AdV-EGFP)

Максимальное значение показателя «ВВВ» на 30-е сутки эксперимента составило 17, что превышает аналогичный показатель в опытах с инъекцией плазмиды pBud-VEGF-FGF2 на 3 балла и трансплантацией ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 на 4 балла (Рис. 92). Средний прирост показателя «ВВВ» в опыте (AdV-GDNF) составил через 30 суток 8, а в контроле (AdV-EGFP) - 4 баллов.

Рис. 92. Результаты теста «ВВВ» при введении плазмиды pBud-VEGF-FGF2 (белые треугольники и AdV-GDNF (черные квадратики). По оси абсцисс - сутки после КТСМ

Таким образом, при прямой генной терапии инъекция плазмиды pBud- VEGF-FGF2 и аденовируса AdV-GDNF в зону повреждения различным образом влияет на восстановлении функции спинного мозга.

На 30 сутки после КТСМ и введения аденовируса AdV-GDNF установлено достоверное превышение значения показателя «ВВВ» на 3 балла по сравнению с инъекцией плазмиды pBud-VEGF-FGF2.

Сохранность ткани

На 30 сутки после контузионной травмы и введения непосредственно в зону повреждения рекомбинантного аденовируса AdV-GDNF, наблюдали уменьшение площади участка повреждения (Рис. 93): на расстоянии 3 мм от эпицентра повреждения на 20% в ростральном направлении и на 17% в каудальном направлении. На расстоянии 5 мм от эпицентра площадь участка повреждения уменьшалась, соответственно, на 75 и 70 %, при сравнении с соответствующим показателем у контрольной группы животных c введением рекомбинантного аденовируса AdV-EGFP.

Рис. 93 А и Б. Фрагмент спинного мозга крысы, зоны 1 и 2 на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы при трансплантации: А - AdV-EGFP, Б - AdV- GDNF. Увеличение 20х10

Варианты генно-клеточной терапии, из числа исследованных нами, неравнозначны по своему сдерживающему влиянию на развитие деструкции ткани спинного мозга. Площадь сохранного вещества к исходу первого месяца после травмы оказалась наибольшей в условиях прямой инъекции плазмиды с генами факторов VEGV и FGF2. Ненамного уступает ей по эффективности прямая инъекция аденовируса с геном глиального нейротрофического фактора. Клеточно-опосредованные способы введения генов терапевтических факторов, как и чисто клеточная терапия, дали менее выраженный результат (Рис. 94).

Рис. 94. Площадь сохранного вещества (мм) на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении (по оси ординат). По оси абсцисс - экспериментальные группы. * - р<0,05; ** - р<0,005

Суммарная площадь патологических полостей. На 30-е сутки после КТСМ и введения в зону травматического повреждения рекомбинантного аденовируса AdV-GDNF зарегистрировано уменьшение суммарной площади патологических полостей, по сравнению с контролем (AdV-EGFP) (Рис. 95 и 96). Наибольшая разница наблюдалась на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в вентро-медиальной части передних канатиков рострального фрагмента. Здесь опытное значение меньше контрольного более чем в 7 раз, в аналогичной части каудального фрагмента - в 5,5 раза (р<0,05). Такая же тенденция наблюдается в зонах латеральной части боковых канатиков рострального фрагмента в среднем - в 6 и каудального фрагмента - в 3 раза (р<0,05).

Рис. 95. Суммарная площадь патологических полостей, зона 2 на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы при трансплантации: А - AdV-EGFP, Б - AdV- GDNF. Увеличение 40х10

Рис. 96. Фрагмент белого вещества в зоне латеральной части бокового канатика слева в пределах фронтальной плоскости, проходящей через центральный канал: А - AdV-EGFP (контроль), Б - AdV-GDNF (опыт). Звездочками обозначены патологические полости. Поперечные срезы, окрашенные толуидиновым синим. Увеличение 40х10

Также достоверная разница между опытным (AdV-GDNF) и контрольным (AdV-EGFP) значениями суммарной площади патологических полостей выявленана расстоянии 5 мм от эпицентра травмы. В вентро- медиальной части передних канатиков рострального фрагмента суммарная площадь патологических полостей в опыте меньше, чем в контроле более чем в 7,5 раза, каудального фрагмента - 6 (р<0,05), в зонах латеральной части боковых канатиков в латеральном и каудальном фрагментах - в 7 и 6 раз соответственно.

Сравнение двух вариантов прямой генной терапии - инъекции плазмиды, несущей гены ангиогенных и нейротрофических факторов VEGF и FGF2, и инъекции аденовируса с геном глиального нейротрофического фактора показало, что оба способа способствуют уменьшению суммарной площади патологических полостей, однако каких-либо существенных преимуществ одного перед другим выявить не удалось. Суммарная площадь патологических полостей в опыте с AdV-GDNF на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в зонах боковых канатиков рострального и каудальнго фрагментов достоверно не отличается от таковой в опыте с плазмидой pBud- VEGF-FGF2. Хотя ближе к эпицентру травмы, на расстоянии 3 мм в ростральном направлении этот показатель несколько больше в опыте с введением AdV-GDNF, чем в опыте с плазмидой pBud-VEGF-FGF2.

В то же время, прямое введение аденовируса с геном GDNF привело к существенно более выраженному уменьшению суммарной площади патологических полостей, чем введение ККП, трансдуцированных этим же вирусом (Рис. 97). Так, на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в ростральном направлении этот показатель меньше, чем в эксперименте с клеточно-опосредованной терапией (ККП+AdV-GDNF) в среднем 1,5 раза.

Рис. 97. Мелкие патологические полости. Вверху - AdV-GDNF, внизу - ККП+AdV-GDNF. Увеличение 60х10

Количество миелиновых волокон. На сроке 30 суток после контузионной травмы и введения в зону повреждения рекомбинантного аденовируса AdV-GDNF (опыт) количество миелиновых волокон больше, чем при введении рекомбинантного аденовируса AdV-EGFP (контроль) в следующих соотношениях:

• на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в вентро-медиальной части переднего канатика справа и слева в ростральном направлении на 42% и 38%, в каудальном направлении - на 28% и 30%, в боковых канатиках в среднем в 2 раза как в ростральном, так и в каудальном направлениях;
• на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в вентро-медиальной части переднего канатика справа и слева в ростральном фрагменте на 35%, каудальном - на 30%; в ростральном фрагменте боковых канатиков на 48%, в каудальном на 46%.

В целом, количество миелинизованных волокон при терапии с помощью рекомбинантного аденовируса AdV-GDNF несколько выше, чем при прямом введении плазмиды pBud-VEGF-FGF2 (Рис. 98), но в обоих случаях поддерживающее влияние генной терапии на миелинизацию следует признать довольно умеренным по сравнению с клеточно-опосредованной терапией.

Рис. 98. Количество миелиновых волокон (по оси ординат) на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в ростральном фрагменте на 30-е сутки эксперимента в латеральной части бокового канатика справа (зона 3). По оси абсцисс - экспериментальные группы

Назад | Оглавление | Вперед

Дата публикации (обновления): 16 февраля 2017 г. 15:28

.

	Жизнь после травмы спинного мозга