1.5.1. Вирусные векторы для доставки терапевтических генов при травме спинного мозга

Одной из ключевых задач разработки «инструментов» для генной терапии является создание экспрессионных генетических конструкций, обеспечивающих перенос рекомбинантных генов в целевые клетки invitro и in vivo. Идеальная векторная система в генной терапии не требует инвазивных методов доставки, ограничена действием только на клетки- мишени, обеспечивает экспрессию известного количества трансгенных продуктов в течение определенного периода времени. Вирусы представляют собой естественную биологическую систему переноса генов в эукариотические клетки. Доставка генов при помощи вирусных векторов (аденовируса и вируса простого герпеса) в настоящее время остаётся одним из ведущих методов направленной терапии нарушений в центральной нервной системе.

Аденовирусы в качестве векторов для доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки являются одними из наиболее исследованных и безопасных с точки зрения неконтролируемой дифференцировки трансплантированных клеток и онкогенности (Gonzalez et al. 2009, Gray et al. 2011, Gray et al. 2011). Аденовирусные векторы эффективно переносят гены как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, не встраиваются в геном, обеспечивают высокие титры рекомбинантного вируса и высокий уровень экспрессии вводимых генов. Показано, что локальная доставка в область травмы спинного мозга гена глиального нейротрофического фактора (GDNF) при помощи аденовирусного вектора предотвращает ретроградную атрофию кортикоспинальных мотонейронов и стимулирует восстановление двигательной функции (Tang et al. 2004). Доставка того же рекомбинантного аденовируса в комбинации с L-аргинином при травматическом повреждении мозга не восстанавливает функциональный дефицит, но уменьшает область повреждения (Degeorge et al. 2011).

Аденоассоциированный вирус дикого типа имеет некоторые преимущества для генной терапии. Одним из основных преимуществ является то, что этот вирус не вызывает заболеваний человека. Аденоассоциированный вирус может инфицировать неделящиеся клетки и может встраиваться в геном хозяина по специфическим участкам девятнадцатой хромосомы. Данная особенность делает аденоассоциированный вирус более предсказуемым, чем ретровирусы. Ретровирусы являются потенциально опасными как мутагены, так как встраиваются в геном хозяина случайным образом, что может привести к возникновению раковых опухолей.

Аденоассоциированный вирус также обладает очень низкой иммунногенностью, по-видимому, ограниченной низкой эффективностью образования нейтрализующих антител, в то время как для последних четко не показана цитотоксичность. Описанные особенности, а также возможность заражать неделящиеся клетки, обуславливает преимущества аденоассоциированного вируса над аденовирусами для генной терапии (Ruitenberg et al. 2002). Использование аденоассоциированного вируса имеет также и некоторые недостатки. Ёмкость генома вируса, доступная для клонирования терапевтических генов, составляет всего около 4800 пар нуклеотидов. Таким образом, данный вектор не подходит для клонирования крупных генов.

Лентивирусы также считаются перспективными в разработке методов генной терапии. Лентивирусы способны доставлять значительное количество генетического материала в клетку хозяина и обладают уникальной среди ретровирусов способностью реплицироваться в неделящихся клетках. Лентивирусы, как и аденовирусы, способны инфицировать различные клетки. В то же время, за счет интеграции в геном клетки-хозяина они обеспечивают долговременную экспрессию и передачу трансгена дочерним клеткам при делении.

Технология вирусной трансдукции была применена для фенотипирования клеток в области травмы спинного мозга, в том числе в составе глиального барьера. Так, после инъекции лентивирусного вектора с геном зеленого флуоресцентного белка в область глиального рубца через две недели после травмы спинного мозга крысы иммуногистохимическим методом с антителами против маркеров различных нейральных клеток было установлено, что рубец ограничен скоплением реактивных астроцитов, предшественников нейронов, микроглии и олигодендроцитов, а также макрофагов (Hendriks et al. 2007).

По мнению авторов, технология прямого введения гена может быть использована не только для идентификации клеток в глиальном барьере, но и для доставки в область повреждения опосредованно через реактивные астроциты, которые являются основным компонентом данного барьера, терапевтических генов, например генов нейротрофинов. После введения в область гемисекции спинного мозга крысы комбинации хондроитиназы ABC и полноразмерной антисмысловой сДНК белка промежуточных филаментов виментина показано уменьшение выраженности глиального рубца и патологических полостей за счет деградации хондроитинсульфат протеогликанов и угнетения синтеза виментина (Xia et al. 2008).

Введение в область гемисекции спинного мозга мыши лентивирусного вектора с короткими РНК, образующими шпильки (shRNA), специфически снижало экспрессию генов глиального фиблилярного кислого белка (GFAP) и виментина путем РНК- интерференции, что сопровождалось снижением реактивности астроцитов и выраженности образования глиального барьера (Desclaux et al. 2009). Этот подход рассматривается авторами в качестве перспективного способа модулирования фенотипа и поведения астроцитов с целью поддержания нейрорегенерации. В условиях преодоления дефекта спинного мозга крысы при дорсальной его гемисекции на уровне С3 при помощи его заполнения аутологичными стромальными клетками костного мозга исследован эффект прямого локального введения лентивирусного вектора с геном NT-3 (Toylor et al. 2006). Генная терапия активировала прорастание аксонов через глиальный барьер, но дальнейший их рост замедлялся и был незначительным.

С использованием системы клонирования Gateway были получены рекомбинантные аденовирусы и лентивирусы, экспрессирующие разные изоформы сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF121, VEGF165, VEGF189), основной фактор роста фибробластов FGF2 и глиальный нейротрофический фактор gdnf (Черенкова и др. 2012).

Вирусные векторы обладают высокой трансфекционной активностью, но не считаются полностью безопасными из-за вероятности инсерционного мутагенеза, выраженного воспалительного и иммунного ответов, а также токсичности.

Среди других недостатков вирусных векторов - отсутствие постоянной экспрессии (аденовирус), малый размер вставки трансгенной конструкции (аденовирус, рекомбинантный адено-ассоциированный вирус), кратковременная экспрессия трансгенов (герпесвирусы), трансдукция только делящихся клеток (ретровирусы), методы получения трудоемки и дороги (Bleiziffer et al. 2007). Альтернативой генно-клеточной терапии при помощи вирусных векторов является применение невирусных (плазмидных) векторов, у которых, несмотря на более низкую трансфекционную активность, вышеупомянутые недостатки либо не проявляются совсем, либо в значительно меньшей мере. В случае применения невирусных векторов для достижения требуемой эффективности трансфекции пока приходится идти по нежелательному пути увеличения количества трансгена.

Назад | Оглавление | Вперед

Дата публикации (обновления): 10 февраля 2017 г. 14:31

.

	Жизнь после травмы спинного мозга