1.5.2. Невирусные векторы

Плазмидный вектор

Перспективы применения более безопасных невирусных векторов для доставки плазмидной ДНК связывают с успехами в области разработки синтетических платформ на основе биосовместимых и биорастворимых материалов.

Необходимость участия дополнительных химических и/или физических факторов для обеспечения эффективного поступления в клетки- мишени нуклеиновых кислот и их внутриклеточной экспрессии считается общепризнанной. Однако рядом исследований in vivo продемонстрирована способность чистой ДНК без привлечения дополнительных факторов к экспрессии в нейронах.

На модели преодоления разрыва седалищного нерва при помощи аутоонервной вставки показано, что прямое введение двухкассетной плазмиды pBud-VEGF-FGF2, экспрессирующей клонированные гены сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf) и фактора роста фибробластов 2 (fgf2) человека в центральный и периферический отрезки нерва, а также непосредственно в аутонервную вставку стимулирует реваскуляризацию и регенерацию нерва (Масгутов и др. 2011).

Было показано, что «голая» плазмидная ДНК участвует в экспрессии гена в стволе мозга при внутримышечном введении в язык, или при внутрижелудочковой инъекции (Morris et al. 2004). Введение «голой» плазмидной ДНК в область повреждения спинного мозга характеризуется низким уровнем экспрессии трансгена в нейронах и астроцитах (Choi et al. 2007). Механизм трансфекции клеток центральной нервной системы «голой» плазмидной ДНК требует дальнейшего изучения.

Липоплексы

Вектор с терапевтическим геном должен быть доставлен в ядро клетки для репликации ДНК или в околоядерную область для синтеза мРНК. Для трансфекции клеток векторы должны связаться с их плазматической мембраной и интернализоваться путем эндоцитоза. Для улучшения результатов трансфекции клеток-мишеней ДНК должна быть защищена от повреждения. При этом также важно обеспечить наиболее динамичное поступление терапевтического гена в клетку. Для этой цели разрабатывают и применяют липо- и полиплексы.

Липоплексы представляет собой организованную структуру липидов по типу мицелл или липосом, включающую в свой состав ДНК. Для создания липоплексов наиболее перспективными считаются катионные липиды, которые легко образуют комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Катионные липиды являются одними из самых эффективных невирусных векторов и широко используются для трансфекции генов в культуре нейронов. Будучи заряженными, катионные липиды свободно взаимодействуют с клеточной мембраной, включаются в эндоцитоз, в результате чего ДНК оказывается внутри клеток. Кроме того, катионные липиды защищают ДНК от деградации, осуществляемой с участием клеток. Слияние липоплексов с клеточной мембраной может не сопровождаться поступлением ДНК в цитоплазму (Elouahabi et al. 2005). Проникшие в цитоплазму путем эндоцитоза липоплексы, находясь в непосредственной близости от клеточной мембраны и на удалении от ядра, выделяются из ранних эндосом и освободившаяся ДНК может подвергаться расщеплению цитоплазматическими нуклеазами.

Предпочтительное применение катионных липидов связано с простотой применения и возможностью доставлять трансгенные конструкции больших размеров. Если ранние составы катионных липидов обеспечивали в первичной культуре трансфекцию примерно 1-3% нейронов (Kaech et al. 1996, Wiesenhofer et al. 2000, da Cruz et al. 2004), то такие реагенты, как Lipofectamine™ 2000, дают возможность трансфицировать до 20-25% нейронов (Ohki et al. 2001). Недавние исследования новых комплексов, например L3/DOPE/DNA, показали еще большую эффективность трансфекции, чем у Lipofectamine™ 2000 (Liu et al., 2011).

Полиплексы

Полиплексы — комплексы полимеров с ДНК. Большинство из них сконструировано на основе биорастворимых катионных полимеров (полиэфиры, полиуретаны, полимеры на основе полилизина, полиэтиленимина, фосфорсодержащие полимеры, полимеры с деградирующими боковыми цепями) (Luten et al. 2008). При этом ионные взаимодействия играют решающую роль. В отличие от липоплексов, полиплексы не способны самостоятельно освобождать ДНК в цитоплазму. Как правило, для этого дополнительно требуется введение эндосомолитических агентов. Но некоторые полимеры, такие как полиэтиленимин, хитозан и триметилхитозан сами способны разрушать эндосомы и обеспечивать выход гена в цитоплазму.

Для доставки трансгена в перинуклеарную область, а затем в ядро, решающее значение имеет цитоплазматический транспорт эндосом. Согласно существующему представлению, ДНК, прежде чем импортироваться в ядро, должна покинуть эндосому. Предполагается, что способы этого высвобождения для липо- и полиплексов различны. Механизм отделения ДНК от вектора в случае полиплекса остается неясным. Поступление трансгена в ядро может пассивно осуществляться во время митоза или в результате активного транспорта через интактную нуклеолемму. Для эндосом, несущих липоплексы, постулирована возможность прямого слияния с нуклеолеммой.

Наночастицы

Последние достижения в области нанотехнологий стимулировали разработку невирусных носителей генов на основе наночастиц. Наночастицы золота, покрытые плазмидной ДНК, могут быть in vitro доставлены в нейроны методом бомбардировки (Usachev et al. 2000). Однако этот метод позволяет трансфицировать только 10% нейронов в первичной культуре. Доставка ДНК in vivo при внутривенной инъекции покрытых поли-Ь-лизином наночастиц оксида железа была более результативной в отношении нейронов и глии (Xiang et al. 2003). Эти переносчики легко проходят через гематоэнцефалический барьер и имеют низкую токсичность. Внутрижелудочковая инъекция наночастиц кремния (ORMOSIL) в комплексе с плазмидной ДНК обеспечивает эффективную трансфекцию нейронов. Результаты аналогичны таковым при трансфекции при помощи вируса простого герпеса, но менее токсичны и иммунологически более предпочтительны (Bharali et al. 2005). В заключение следует отметить, что нейроны являются наиболее проблемным типом клеток для трансфекции in vitro и in vivo (Washbourne et al. 2002). Это связано, в частности, с их принадлежностью к статической клеточной популяции и c наличием ряда внутриклеточных препятствий, которые должны преодолеть трансгены прежде чем они будут импортированы в ядро.

Многочисленные данные экспериментов свидетельствуют о том, что прямая доставка генов стимуляторов регенерации в область повреждения спинного мозга улучшает двигательную функцию, снижает гибель нейронов и олигодендроцитов, уменьшает область повреждения и стимулирует регенерацию нервных волокон (Табл. 2). При данной патологии наибольшее количество работ выполнено с доставкой генов нейротрофических факторов. Следует отметить, что в этом направлении практически одновременно были начаты исследования с доставкой генов как при помощи вирусных, так и невирусных векторов. Но как видно из приведенной таблицы, исследования с применением вирусных векторов представлены шире, несмотря на вышеупомянутые недостатки. В большинстве работ по генной терапии при травме спинного мозга главной причиной выбора именно вирусных векторов, по-видимому, является их высокая трансфекционная активность.

Таблица 2.

Опыт изучения эффективности прямой генной терапии при травме спинного мозга

Инъекция трансгена при помощи вирусных векторов позволяет трансдуцировать клетки, локализация которых ограничена достаточно узкой областью введения. Между тем, при травме спинного мозга в патологический процесс вовлекается обширная область, прилегающая к эпицентру травмы. Поэтому для наиболее полного проявления терапевтического действия вводимого гена необходимо обеспечить его экспрессию не только в эпицентре травматического повреждения, но и в прилегающих областях, как правило, достаточно удалённых от этой зоны. Для решения этой задачи наиболее перспективным подходом представляется доставка терапевтических генов на клеточных носителях. С этой целью интенсивно исследуют клетки крови пуповины, обладающие низкой иммуногенностью, способностью сдерживать воспалительную реакцию, оказывать нейротрофическое действие и стимулировать неоваскуляризацию (Park et al. 2011, Chen et al. 2008).

Назад | Оглавление | Вперед

Дата публикации (обновления): 10 февраля 2017 г. 16:09

.

	Жизнь после травмы спинного мозга