|
|
Жизнь |
|
|
|
| ||||
Генно-клеточная терапия для стимулирования нейрорегенерации при травме спинного мозгаШаймарданова Гульнара ФердинантовнаТравма спинного мозга вызывает комплекс патологических сдвигов, включающий гибель нейронов и глиальных клеток, дегенерацию нервных волокон, демиелинизацию, активацию микроглии и макрофагов. Эти нарушения являются причиной устойчивого функционального дефицита, усугубляемого естественными лимитирующими нейрорегенерацию факторами в центральной нервной системе. Поиск новых методов лечения травмы спинного мозга является актуальным. Цель исследования: Оценить и сопоставить эффективность посттравматической регенерации спинного мозга крысы в условиях прямой и опосредованной клетками крови пуповины человека доставки в область повреждения клонированных генов нейротрофических и ангиогенных факторов VEGF, FGF2 и GDNF и трансплантации немодифицированных клеток обонятельной выстилки человека и клеток крови пуповины человека. ОГЛАВЛЕНИЕ Глава 1. Обзор литературы1.1. Клинические аспекты травмы спинного мозга 1.2. Патогенез травмы спинного мозга: клеточные, молекулярные и тканевые аспекты 1.3. Молекулярные факторы контроля нейрорегенерации при травме спинного мозга 1.3.1. Ингибиторы роста аксонов 1.3.2. Молекулы внеклеточного матрикса 1.3.3. Молекулы-навигаторы 1.3.4. Молекулы потенциальных стимуляторов нейрорегенерации 1.3.4.1. Сосудистый эндотелиальный фактор роста 1.3.4.2. Фактор роста фибробластов 1.3.4.3. Глиальный нейротрофический фактор GDNF 1.3.4.4. Молекулы адгезии 1.4. Клеточная терапия при травме спинного мозга 1.4.1. Клетки обонятельной выстилки 1.4.2. Шванновские клетки 1.4.3. Эмбриональные стволовые клетки 1.4.4. Нейральные стволовые клетки 1.4.5. Мезенхимные стволовые клетки 1.4.6. Клетки стромы костного мозга 1.4.7. Клетки крови пуповины 1.5. Генная терапия при травме спинного мозга 1.5.1. Вирусные векторы для доставки терапевтических генов при травме спинного мозга 1.5.2. Невирусные векторы 1.6. Клеточно-опосредованная доставка терапевтических генов при травме спинного мозга (генно-клеточная терапия) Глава 2. Материалы и методы2.1. Животные и экспериментальные группы 2.1.2. Дозированная контузионная травма спинного мозга и латеральная гемисекция 2.1.3. Клетки обонятельной выстилки человека (КОВ) 2.1.4. Клетки крови пуповины человека (ККП) 2.2. Гистологические исследования 2.2.1 Зоны морфометрии 2.2.2. Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM) 2.2.3. Иммуногистохимия 2.3. Создание AdV-GDNF и трансдукция ККП 2.4. Оценка восстановления функции спинного мозга 2.5. Световая микроскопия 2.6. Программное обеспечение и статистическая обработка результатов Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение3.1. Эффекты трансплантации в область травматического повреждения нативных КОВ и ККП человека, их жизнеспособность и миграционный потенциал 3.1.1. Влияние трансплантации КОВ на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы 3.1.2. Влияние трансплантации ККП на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы Результаты иммуногистохимических исследований 3.3. Эффективность посттравматической регенерации при прямой генной терапии плазмидой pBud-VEGF-FGF2 3.4. Влияние ККП, трансдуцированных аденовирусом AdV-GDNF, на посттравматическую регенерацию 3.5. Эффективность посттравматической регенерации при прямой генной терапии аденовирусом AdV-GDNF Список сокращений
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемы Травма спинного мозга вызывает комплекс патологических сдвигов, включающий гибель нейронов и глиальных клеток, дегенерацию нервных волокон, демиелинизацию, активацию микроглии и макрофагов. Эти нарушения являются причиной устойчивого функционального дефицита, усугубляемого естественными лимитирующими нейрорегенерацию факторами в центральной нервной системе. Поиск новых методов лечения травмы спинного мозга является актуальным. Среди немногочисленных экспериментальных подходов стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга одно из ведущих мест принадлежит клеточной терапии. Трансплантируемые клетки необходимы для восстановления тканевого матрикса и формирования направляющих путей для роста аксонов, поддержания выживания нейронов и глиальных клеток, удлинения аксонов, стимулирования процесса миелинизации. Этим условиям в разной степени удовлетворяют клетки нескольких типов, трансплантируемых при экспериментальной травме спинного мозга. Интерес вызывают работы, выполненные с трансплантацией стволовых мезенхимных клеток и нейральных клеток обонятельной выстилки (КОВ) и клеток крови пуповины человека (ККП). КОВ человека обладают способностью стимулировать регенерацию и миелинизацию поврежденных аксонов спинного мозга крысы и частично восстанавливать двигательную и чувствительную функции (Ramon-Cueto et al. 1998, Викторов и др. 2009). КОВ продуцируют комплекс нейротрофических факторов, белки внеклеточного матрикса и молекулы адгезии нервных клеток. Интерес к этим клеткам подкреплен возможностью аутотрансплантации, не приводящей к длительному нарушению обоняния. ККП активно изучаются в связи с их низкой иммуногенностью, доступностью, простотой и безопасностью получения, способностью выдерживать длительное хранение, возможностью использования аутологичного материала (Deng et al. 2010, Park et al. 2011, Han et al. 2013). Несмотря на значительное количество исследований с применением клеток данных типов для трансплантаций в спинной мозг, многие вопросы их поведения в ткани реципиента, а также влияние на конкретные события посттравматической дегенерации спинного мозга, остаются неясными. Усилить терапевтический эффект трансплантированных клеток можно за счет применения генетически модифицированных стволовых клеток, обладающих способностью к длительной сверхэкспрессии ключевых факторов, поддерживающих выживание и дифференцировку нейральных клеток и регенераторный потенциал спинного мозга. Представляют интерес сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста фибробластов основной (FGF2), поскольку эти факторы являются одновременно нейротрофическими и ангиогенными. При травме спинного мозга доставка в область повреждения VEGF стимулирует нейрогенез, выживание, миграцию нейронов и рост аксонов (Benton et al. 2009, Mackenzie et al. 2012), а FGF2 стимулирует рост аксонов и восстановление двигательной функции (Moftah et al. 2008, Guzen et al. 2012, Goldshmit et al. 2012), способствует дифференциации предшественников макроглии в зрелые клетки (Ohori et al. 2006, Yang et al. 2012). Результаты различных авторов указывают на синергизм действия этих факторов в ангиогенезе in vitro и in vivo (Seghezzi et al. 1998, Laporte et al. 2011). Помимо перечисленных выше, особый интерес представляет глиальный нейротрофический фактор (GDNF). Имеются данные, что при травме спинного мозга GDNF стимулирует регенерацию аксонов и образование миелина (Zhang et al. 2009, Koelsch et al. 2010). К недостаткам метода непосредственного введения пептидных факторов следует отнести необходимость применения больших доз, быстрое расщепление их эндогенными пептидазами, высокую иммуногенность, длительное присутствие in vivo минипомпы и др. В ходе клинических испытаний с системной доставкой нейротрофических факторов и факторов роста при различных заболеваниях были выявлены побочные эффекты и низкая эффективность (Apfel et al. 2002). Эти осложнения стимулировали поиск других способов увеличения содержания в ткани-мишени стимуляторов регенерации. Из них наиболее эффективным представляется генная терапия. В генной терапии различают два подхода: генно-клеточную терапию (клеточно-опосредованная генная терапия), предполагающую применение клеток в качестве носителей трансгенов, и прямую генную терапию непосредственно инъекцией ДНК-содержащих векторов. При генно-клеточной терапии важным критерием отбора клеток, предназначенных для трансплантации, является возможность трансфекции терапевтическими генами с высокой эффективностью их экспрессии в ткани спинного мозга реципиента. Кроме того эффективность клеточноопосредованного подхода зависит от выбора конкретного терапевтического гена и типа трансфицируемых клеток, применяемых для трансплантации. Для стимулирования нейрорегенерации также активно исследуют эффективность двух принципиально различных способов доставки терапевтических генов, не связанных с клеточными носителями - это доставка трансгенов при помощи вирусных и невирусных векторов. Одним из наиболее эффективных и безопасных носителей терапевтических генов считается адено-ассоциированный вирус (Исламов и др. 2007, Colella et al. 2010). Они обладают высокой трансфекционной активностью, но не считаются полностью безопасными из-за вероятности инсерционного мутагенеза, выраженного воспалительного и иммунного ответов и токсичности. Среди других недостатков вирусных векторов - отсутствие постоянной экспрессии (аденовирус), малый размер вставки трансгенной конструкции (аденовирус, рекомбинантный адено-ассоциированный вирус), кратковременная экспрессия трансгенов (герпесвирусы), трансдукция только делящихся клеток (ретровирусы), методы получения трудоемки и дороги (Bleiziffer et al. 2007). Альтернативой генной терапии при помощи вирусных векторов является применение плазмидных векторов, у которых, несмотря на более низкую, чем у вирусных векторов, трансфекционную активность, вышеупомянутые недостатки либо не проявляются совсем, либо проявляются в значительно меньшей мере. Основное преимущество использования плазмидных векторов заключается в том, что на основе промышленного вектора можно конструировать векторы с различным набором необходимых трансгенов, экспрессия которых осуществляется одновременно и независимо. Встроенные в плазмидные конструкции механизмы контроля репликации позволяют регулировать их экспрессионную активность. Вопрос об оптимальном выборе терапевтических генов или их комбинаций и эффективных способах их доставки при травме спинного мозга остается не выясненным. В связи с вышесказанным, была сформулирована цель исследования и поставлены следующие задачи. Цель исследования Оценить и сопоставить эффективность посттравматической регенерации спинного мозга крысы в условиях прямой и опосредованной клетками крови пуповины человека доставки в область повреждения клонированных генов нейротрофических и ангиогенных факторов VEGF, FGF2 и GDNF и трансплантации немодифицированных клеток обонятельной выстилки человека и клеток крови пуповины человека. Задачи исследования 1. Изучить эффекты немедленной однократной трансплантации в область травматического повреждения спинного мозга нативных клеток обонятельной выстилки человека и клеток крови пуповины человека, их способность к выживанию и миграционный потенциал. 2. Изучить эффекты немедленной однократной трансплантации в область травматического повреждения клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидами pBud-EGFP и pBud-VEGF-FGF2. Сравнить эффективность стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга крысы при трансплантации в зону повреждения нативных и трансфицированных pBud-VEGF-FGF2 клеток крови пуповины. 3. На модели контузионной травмы спинного мозга крысы изучить эффективность прямой генной терапии путем введения в область повреждения плазмиды pBud-VEGF-FGF2. 4. Оценить эффективность посттравматической регенерации при введении в область контузионного повреждения спинного мозга крысы аденовирусного вектора AdV-GDNF. 5. Изучить эффективность трансплантации в зону контузионного повреждения спинного мозга крысы клеток крови пуповины человека, трансдуцированных AdV-GDNF. 6. Провести иммуногистохимический анализ с использованием маркеров астроцитов S100В; аир рецепторов тромбоцитарного фактора роста PDGFaR и PDGFpR, глиального фибриллярного кислого белка GFAP; транскрипционного фактора Krox20; белка периферического миелина P0; низкоаффинного рецептора фактора роста нервов p75; маркера ядер клеток человека HNu; белка теплового шока HSP25. С помощью специфических маркеров оценить количество и фенотип шванновских клеток, мигрировавших в область повреждения, образование миелина, активацию перицитов и астроцитов, выживаемость и пространственную локализацию генно-модифицированных клеток крови пуповины человека, эффективность экспрессии рекомбинантного гена VEGF. 7. Сравнить эффективность стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга при генной и генно-клеточной терапии по критериям восстановления функции, сохранности ткани, величине патологических полостей, регенерации миелиновых волокон. На модели контузионной травмы спинного мозга изучены эффекты немедленной однократной трансплантации в зону повреждения нативных КОВ и ККП, доказана их высокая выживаемость и способность мигрировать на значительное расстояние, положительное влияние на восстановление двигательной активности и сохранность ткани, рост количества миелиновых волокон и снижение степени кавитации. На модели контузионной травмы спинного мозга впервые в одинаковых условиях эксперимента исследованы морфологические и гистохимические характеристики ткани спинного мозга в ходе генноклеточной терапии с использованием нативных и модифицированных ККП человека. Тестирование в открытом поле (метод «ВВВ») на всех этапах эксперимента позволило соотнести параметры восстановления двигательной активности со структурно-морфологическими изменениями ткани спинного мозга и количественно охарактеризовать терапевтическую эффективность различных вариантов доставки генов нейротрофических и ангиогенных факторов в область травмы. Впервые для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга применена трансплантация в зону травмы ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, экспрессирующей одновременно и независимо гены vegf и fgf2. Обосновывается выбор факторов VEGF, FGF2 и их сочетанного применения для терапии травмы спинного мозга. Одновременно на двух моделях - контузионной травмы и гемисекции - показано, что по сравнению с трансплантацией немодифицированных КОВ, трансплантация ККП человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, дает более высокие показатели сохранности ткани и ремиелинизации в очаге поражения и восстановления функции спинного мозга. Впервые проведено сравнение прямого и ККП-опосредованного способов введения плазмиды pBud-VEGF-FGF2 по их влиянию на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы. Установлено, что непосредственная инъекция плазмидной ДНК мало уступает по эффективности доставке этих же терапевтических генов посредством ККП, а по некоторым показателям (восстановление двигательной активности, размеры патологических полостей) превосходит ее. Впервые выявлены и сопоставлены гистоморфологические проявления посттравматической регенерации, обусловленные применением плазмиды pBud-VEGF-FGF2 непосредственно и в составе клеточных носителей. Установлено, что в результате трансплантации немодифицированных КОВ, а также при прямом и ККП-опосредованном введении плазмиды pBud-VEGF- FGF2 в зоне контузионного повреждения появляются миелиновые волокна диаметром меньше 2 мкм с компактным миелином периферического типа. Источником миелина служат мигрирующие шванновские клетки. Трансплантация ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, оказывает более выраженное поддерживающее влияние на популяцию шванновских клеток, мигрирующих в зону повреждения, чем трансплантация немодифицированных ККП. Субпопуляции шванновских клеток-мигрантов имеют фенотип P0+- и P0+/p75+ в белом веществе, S100В+/GFAP+/Krox20+ и GFAP+/Krox20+ в области вхождения задних корешков и HSP25+/GFAP+/Krox20+ в задних канатиках, то есть, мигрирующие клетки находятся на разных стадиях дифференцировки в зависимости от локализации. ККП-опосредованное введение генов ангиогенного фактора VEGF сопровождается увеличением числа PDGFpR+-периваскулярных клеток, отражающим усиление васкуляризации. Впервые на модели контузионной травмы спинного мозга исследовано действие немедленной однократной трансплантации в зону повреждения вирусной генно-инженерной конструкции AdV-GDNF. Установлено, что терапевтический эффект от трансплантации AdV-GDNF посредством трансдуцированных ККП превышает эффект от прямой генной терапии. 1. Доставка в область контузионной травмы спинного мозга крысы генов нейротрофических и ангиогенных факторов VEGF и FGF2 при помощи плазмидного вектора pBud-VEGF-FGF2, а также гена нейротрофического фактора GDNF при помощи вирусного вектора AdV-GDNF, сдерживает развитие дегенеративных изменений и стимулирует посттравматическую нейрорегенерацию. 2. Опосредованная клетками крови пуповины человека, трансфицированными плазмидой pBud-VEGF-FGF2, доставка терапевтических генов и непосредственное введение той же плазмиды (прямая генная терапия) в область травмы спинного мозга с различной степенью эффективности влияют на параметры нейрорегенерации (уменьшение образования патологических полостей, сохраненность миелиновых волокон, серого и белого вещества и восстановление функции). 3. Доставка в область повреждения спинного мозга крысы гена нейротрофического фактора GDNF при помощи клеток крови пуповины человека, трансдуцированных аденовирусом AdV-GDNF, более эффективно стимулирует посттравматическую регенерацию спинного мозга, чем инъекция в эту же область аденовируса с геном gdnf. Теоретическая и практическая значимость Полученные результаты о стимулирующем влиянии на процессы нейрорегенерации прямой и опосредованной клетками крови пуповины доставки рекомбинантных генов vegf, fgf2 и gdnf доказывают возможность использования плазмидной конструкции pBud-VEGF-FGF2 и аденовирусного вектора AdV-GDNF для дальнейших исследований клеточно-молекулярных механизмов на доклиническом этапе, и последующих клинических испытаний. Полученные свидетельства высокой эффективности прямой генной терапии трансгенами vegf и fgf2, мало уступающей по эффективности клеточно-опосредованной терапии с теми же генами обуславливают необходимость совершенствования метода прямой доставки ДНК, не связанного с клеточными носителями. Результаты исследования имеют значение для работ по усовершенствованию и последующему применению разработанных технологических платформ генетических конструкций в качестве инструмента для формирования на их основе других, более эффективных терапевтических средств, для лечения и реабилитации больных с различного рода травмами спинного мозга и другими нейродегенеративными заболеваниями. Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI съезде анатомов гистологов и эмбриологов России (Саратов 2009), Всероссийском симпозиуме “Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии” (Санкт-Петербург 2010), VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010), 8-й Всероссийской научной конференции “Бабухинские чтения в Орле” (2011), V Российском симпозиуме “Белки и пептиды” (Петрозаводск 2011), Всероссийской научной конференции “Регенеративная биология и медицина” (Москва 2011), V Всероссийском симпозиуме с международным участием “Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии” (Уфа 2012), XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Самара 2012), XXIV Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка 2012), III международной научнопрактической конференции “Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине” (Казань 2012), Всероссийской конфренции с международным участием, посвященной 90-летию со дня рождения Д.С. Гордон (Чебоксары 2012). Публикации По теме диссертации опубликовано 28 печатных работ, из них 15 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК для защиты докторских диссертаций, 12 тезисов докладов на международных всероссийских конференциях, симпозиумах, конгрессе, съезде, зарегистрировано 2 патента (№2459630 «Способ стимулирования нейрорегенерации с помощью генетических конструкций», № 2521225 «Способ регенерации спинного мозга с помощью генетически модифицированных клеток крови пуповины человека»). Связь работы с базовыми научными программами Работа поддерживалась: контрактом ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации № 16.512.11.2101; грантами РФФИ №07-04- 00746-а «Стимулирование регенерации аксонов в центральной и периферической нервной системе с помощью гелевых носителей для стволовых клеток, супрамолекулярных систем с самосборкой, сосудистого эндотелиального фактора роста и ксимедона» (2007-2009 гг.), ОПТЭК «Выживание и дифференцировка мигрирующих в спинной мозг эндогенных шванновских клеток под влиянием нейротрофических факторов» (2012 г.), РФФИ №12-04-31092-мол_а «Сравнение эффективности клеточноопосредованной и прямой доставки генов нейротрофических факторов на посттравматическую регенерацию спинного мозга» (2012-2013 гг.). В раздел Исследования | Вперед Дата публикации (обновления): 16 февраля 2017 г. 15:36 . |
|
|
