|
|
Жизнь |
|
|
|
| ||||
2.1.3. Клетки обонятельной выстилки человека (КОВ)Ткань обонятельного эпителия получали в клинике «Нейровита» от пациентов с разрешения этического комитета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Под местной лидокаиновой анестезией фрагменты обонятельного эпителия размером 10х5 мм иссекали из верхнего отдела верхнего носового хода. Полученную ткань доставляли в лабораторию в растворе Хенкса без Са2+ и Mg2+, содержавшем смесь антибиотиков и антимикотиков (“Gibco”, 1:100). Срок доставки не превышал 2 ч. После повторной промывки в том же растворе из образца ткани обонятельного эпителия удаляли сосуды, ткань измельчали и инкубировали 40 мин при 36.5оС в растворе трипсина и ЭДТА (0.25%), приготовленном на 0.01 М фосфатно-солевом буфере pH 7.4. Действие ферментов блокировали средой DMEM (“Gibco”), содержавшей 3% сыворотки, ткань промывали 3 раза сбалансированным солевым раствором Хенкса и диссоциировали повторным пипетированием в питательной среде. Состав питательной среды: среда DMEM/F12 (“Gibco”), ЭТС 10% (“Gibco”), глутамин 2 мМ (“Gibco”), глюкоза 0.8%, смесь инсулина, трансферрина и селенита натрия (“Gibco”, 1:100), 20 мМ HEPES, факторов роста (только для первичных культур): фактора роста фибробластов (1 нг/мл; “Sigma”), фактора роста нервов (2 нг/мл; “Sigma”). Полученную суспензию клеток центрифугировали в течение 7 мин при 1200 об/мин, осадок ресуспендировали в питательной среде того же состава. Для последующего культивирования использовали клеточные суспензии только с 90-95% жизнеспособных клеток. Диссоциированные клетки культивировали в 12- луночных планшетах на полилизинламининовом субстрате в течение 14 сут. Частичную смену питательной среды проводили 2 раза в неделю. Первичную культуру после формирования сливного монослоя снимали с помощью раствора трипсина и ЭДТА (0.25%). После промывки в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) и центрифугирования клетки ресуспендировали в питательной среде. Клеточную суспензию переносили во флаконы 25 см. Формирующиеся в клеточном монослое прикрепленные к субстрату свободно плавающие нейросферы отбирали и диссоциировали методом ферментной обработки. Суспензию клеток нейросфер культивировали отдельно от прикрепленных к субстрату обкладочных глиальных клеток, фибробластов и стромальных (опорных) клеток. Таким способом культуры пассировали 4 раза. Часть клеток последних пассажей замораживали и хранили в жидком азоте. Состав нейральных стволовых клеток в препарате КОВ определяли по результатам иммуноцитохимического исследования клеток нейросфер 3-го пассажа и последующего культивирования в течение 2 недель после разморозки. Клетки нейросфер экспрессировали преимущественно нестин (белок нейрофиламентов) и В тубулин. После 3 отмывок КОВ в охлажденном (4оС) физиологическом растворе Хенкса определяли жизнеспособность клеток (окраска трипановым синим), которая была не ниже 95%, затем готовили взвесь в концентрации 100 тыс. клеток в 1 мкл раствора Хенкса. Выделение и культивирование КОВ проводилось под руководством профессора И.В. Викторова, соавторы Е.А. Савченко, акад. В.П. Чехонин. КОВ трансплантировали сразу после травмы в две точки в количестве 750 тыс. клеток в 10 мкл среды Хенкса в две точки на расстоянии 7 мм ростральнее и каудальнее от эпицентра травмы и 0,3 мм латеральнее срединной линии (краниальную точку сдвигали вправо, каудальную - влево). Всего 1,5 млн. клеток на крысу. Животным контрольной группы в адекватных условиях вводили среду Хэнкса. Использовали гамильтоновский шприц со стальной иглой № G29, соединённый с микропомпой (Stoelting co., США). Трансплантация КОВ проведена в соавторстве с профессором С.В. Лебедевым, А.В. Карасёвым (ФГУ ГНЦ социальной и судебной психиатрии им. В.П.Сербского, Москва). Назад | Оглавление | Вперед Дата публикации (обновления): 11 февраля 2017 г. 14:04 . |
|
|
