3.1. Эффекты трансплантации в область травматического повреждения нативных КОВ и ККП человека, их жизнеспособность и миграционный потенциал

3.1.1. Влияние трансплантации КОВ на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы

Жизнеспособность и миграционный потенциал. Поддерживающее влияние трансплантируемых клеток и доставляемых ими стимуляторов регенерации на восстановление утраченных функций спинного мозга в значительной мере зависит от выживания и длительности присутствия этих клеток в ткани реципиента и от их миграционного потенциала.

Меченые витальным красителем CFDA-SE КОВ человека (Табл. 3 группа 3), трансплантированные в область повреждения спинного мозга крысы, выявлены в дорсальном отделе белого вещества через 7 суток после КТСМ. Трансплантируемые КОВ выживают в поврежденной ткани и мигрируют из точки введения на расстояние до 2 см как в ростральном, так и в каудальном направлениях. Кроме того, они мигрируют в область очага повреждения и скапливаются преимущественно по его периферии. Меченые КОВ присутствуют в сохраненной ткани белого вещества, проникая также в формирующиеся патологические полости (Рис. 10, 11).

Восстановление функции. Оценка восстановления двигательной активности в открытом поле - тестирование методом «ВВВ» показало, что у крыс контрольной группы (среда Хенкса) происходило постепенное частичное самовосстановление произвольных движений с 7,8±0,2 балла через 1 неделю после операции до 10,5±0,3 баллов к 30 суткам, и 12,5±0,3 в конце эксперимента. У крыс с трансплантацией КОВ восстановление произвольных движений было систематически достоверно более выраженным, чем в контроле, с 8±0,3 до 12,5±0,2 к 30 суткам, и до 15±0,4 к концу эксперимента (Рис. 12).

Рис. 10. Меченые CFDA-SE КОВ человека на расстоянии 7 мм каудальнее эпицентра травмы через 7 суток после их трансплантации в спинной мозг крысы. Флюоресцентная микроскопия. Увеличение 10x10

Рис. 11. Меченые CFDA-SE КОВ человека на расстоянии 7 мм каудальнее эпицентра травмы через 7 суток после их трансплантации в спинной мозг крысы. Свечение CFDA-SE (зеленый цвет), ядра окрашены DAPI (синий цвет). Конфокальная микроскопия. Увеличение 40х10

Средний прирост показателя «ВВВ» при трансплантации КОВ, составил через 30 суток 4,5±0,4, а в контроле - 2,5±0,3 (р<0,05), через 60 суток 5,8±0,3 и 4,5±0,3 (р<0,05), соответственно.

Положительное влияние трансплантации КОВ на восстановление произвольных движений наиболее сильно проявляется при анализе относительных показателей. Так, доля животных с количеством баллов 13 и более составила через 30 суток в контрольной группе 0%, а в опыте 50% (р<0,05), через 60 суток - 25% и 84% (р<0,05), соответственно. В опытной группе доля животных с максимальным приростом показателя (более 5 баллов) через 60 суток после КТСМ была также существенно выше, чем у контрольных крыс: 100% и 38%, соответственно (р<0,05).

Рис. 12. Результаты теста «ВВВ» при трансплантации нативных КОВ. По оси ординат - баллы, по оси абсцисс - недели после КТСМ и трансплантации. Черные квадратики - опыт, белые кружочки - контроль (среда Хенкса)

Сохранность ткани. К 30 суткам эксперимента на всех изучаемых расстояниях от эпицентра травматического повреждения в группе животных с трансплантацией КОВ установлено уменьшение области деструкции серого вещества. Так, на поперечных срезах спинного мозга в эпицентре отмечено сокращение площади этой области в опыте более чем в 3 раза по сравнению с контролем (среда Хенкса). Хотя к 60 суткам эксперимента различие по данному показателю уменьшается в большинстве исследованных плоскостей, проходящих на различном расстоянии от эпицентра травмы, тем не менее, в опыте площадь области повреждения серого вещества сохраняется достоверно меньшей, чем в контроле. Эта тенденция прослеживается как в ростральном, так и в каудальном фрагментах.

К 30-м суткам эксперимента на всех изучаемых расстояниях от эпицентра травматического повреждения в группе животных с трансплантацией клеток установлено уменьшение области деструкции серого вещества. Так, в эпицентре площадь этой области на поперечных срезах спинного мозга в опыте более чем в 3 раза меньше, чем в контроле (Рис. 13 А).

Рис. 13. Площадь (по оси ординат, мм ) области деструкции серого (А и Б) и белого (В и Г) вещества в поперечном срезе спинного мозга на различном расстоянии от эпицентра травмы (по оси абсцисс, мм: слева от «0» - в каудальном, справа от «0» - в ростральном направлении) на 30 (А и В) и 60 (Б и Г) сутки после травмы. * - р<0,05 при сравнении показателей в контроле (среда Хенкса, светлые символы) и опыте (КОВ, темные символы)

Различие по данному показателю к 60-м суткам эксперимента уменьшается в большинстве исследованных плоскостей, проходящих на различном расстоянии от эпицентра травмы, площадь области повреждения серого вещества в опыте сохраняется достоверно меньшей, чем в контроле. Эта тенденция прослеживается как в ростральном, так и в каудальном фрагментах (Рис. 13 Б, Рис. 14). В сером веществе опытной группы с трансплантацией КОВ (Рис. 14 А и Б) видны тела крупных нейронов, их ядра и тигроидое вещество в отличие от контроля (среда Хенкса) (Рис. 14 В).

В белом веществе на тех же сроках эксперимента уменьшение площади деструкции в опыте еще более выражено. Эти различия проявляются в максимальной степени в эпицентре травмы и в непосредственной близости от него (Рис. 13 В, 13 Г).

Рис. 14. Фрагменты серого вещества на поперечном срезе спинного мозга, окрашенные толуидиновым синим на 60 сутки после травмы и трансплантации КОВ. А и Б - контроль (среда Хенкса), В и Г - опыт КОВ. Звездочки - полости, ЦК - центральый канал. Увеличение 20х10

Суммарная площадь патологических полостей. Через 30 суток после КТСМ и немедленной трансплантации КОВ выявлено снижение суммарной площади патологических полостей в белом веществе спинного мозга как в ростральном, так и в каудальном направлениях от эпицентра травмы по сравнению с контрольной группой (Рис. 15). Существенное уменьшение показателя суммарной площади патологических полостей прослежено в опытной группе на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении. Оно наиболее выражено в белом веществе передних канатиков (зона 1 и зона 2). В зоне 1 этот показатель при трансплантации КОВ меньше в 3,7 раз (р<0,05), в зоне 2 - в 16 раз, в зонах 3 и 4 - в 2 раза (р<0,05). На расстоянии 5 мм от эпицентра травматического повреждения в зонах 1 и 2 рострального фрагмента этот показатель в опыте в 5 и в 4 раза меньше, а в зонах 3 и 4 - в 2 раза меньше, чем в контроле (р<0,05).

Рис. 15. Суммарная площадь полостей в белом веществе по оси ординат (в мм ) при трансплантации КОВ на расстояниях 3 мм (А) и 5 мм (Б) в каудальном направлении от эпицентра КТСМ. По оси абсцисс - зоны морфометрии. Белые столбики - опыт, серые столбики - контроль (среда Хенкса). 30 суток после операции и трансплантации. * - P<0,05

На 60-е сутки эксперимента положительное влияние КОВ сохранилось: суммарная площадь патологических полостей в изучаемых зонах морфометрии в опыте в среднем в 2 раза меньше, чем в контроле, несмотря на уменьшение абсолютных значений и в опыте, и в контроле.

Количество миелиновых волокон. К 30-м суткам эксперимента на расстоянии 5 мм каудальнее эпицентра травмы не выявлено достоверного преобладания количества миелиновых волокон в опытной группе животных (КОВ). Однако на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы практически во всех исследованных областях белого вещества количество миелиновых волокон в опытной группе превышает их количество в контроле (среда Хенкса) (Рис. 16).

Рис. 16. Количество миелиновых волокон (по оси ординат) при трансплантации КОВ (белые столбики) на расстояниях 3 мм (А) и 5 мм (Б) в каудальном направлении от эпицентра КТСМ. По оси абсцисс - зоны морфометрии. Серые столбики - контроль (среда Хенкса). 30 суток после операции и трансплантации. * - P<0,05

В зоне 1 этот показатель при трансплантации клеток больше в 1,5 раза (р<0,05), в зоне 3 - в 2 раза (р<0,05). Аналогичная позитивная картина соотношения количества сохранных миелиновых волокон в контроле и опыте отмечена на соответствующих расстояниях в ростральном направлении от эпицентра травматического повреждения.

Количество миелиновых волокон в изучаемых зонах морфометрии в опыте с трансплантацией КОВ не достигает того количества волокон, которое мы видим в интактном спинном мозга (Рис. 17 справа). В зонах белого вещества, расположенных в непосредственной близости к серому веществу (нижняя часть рисунков) в опыте с трансплантацией КОВ (Рис. 17 слева) процесс регенерации происходит за счет пролиферации глиальных компонентов.

Рисунок 17. Фрагменты белого вещества спинного мозга: на 60-е сутки после КТСМ и трансплантации КОВ на расстоянии 3 мм в каудальном направлении от эпицентра травмы (слева); интактного животного (справа). Стрелки указывают на волокна. Увеличение 20х10

К 60-м суткам после повреждения на расстоянии 3 мм от эпицентра травматического повреждения в контроле (среда Хенкса), как в ростральном, так и каудальном направлениях отмечена выраженная деструкция миелиновых волокон в белом веществе (Рис. 18 А, В). Она характеризуется глубокими нарушениями структуры миелиновой оболочки, расслоением миелина и образованием крупных вакуолей по периферии волокон большого диаметра. Присутствуют остатки миелиновой оболочки с фрагментами осевых цилиндров или с полностью разрушенными осевыми цилиндрами. В большинстве миелиновых волокон осевые цилиндры сохранены, но их структура значительно изменена. Считается, что подобные волокна могут проводить импульсы, но с существенно меньшей скоростью (Lasiene et al. 2008).

Рис. 18. Крупные (более 2 мкм) миелиновые волокна в белом веществе спинного мозга крысы через 60 суток после травматического повреждения на расстоянии 3 мм каудальнее эпицентра травмы. А и В - контроль (среда Хенкса); Б и Г - при трансплантации КОВ (опыт). А и Б - в вентро- медиальной части переднего канатика, в области, прилежащей к передней срединной щели, правая сторона (зона 1). В и Г - в латеральной части бокового канатика в пределах фронтальной плоскости, проходящей через центральный канал, правая сторона (зона 3). Увеличение А, В, Г 8000 Б - 25000 TEM

На сроке 60 сутки после КТСМ и трансплантации КОВ в зонах 2 и 3 на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы, как в ростральном, так и в каудальном направлении, с помощью ТЕМ установлено увеличение количества миелиновых волокон с миелином в 1,6 раза (р<0,05) по сравнению с контролем (среда Хенкса) с преобладанием волокон диаметром менее 2 мкм (Рис. 18 Б, Г; Рис. 19 Б). Их осевые цилиндры не разрушены. В осевых цилиндрах этих волокон видны митохондрии и микротрубочки, что указывает на активный синтез и транспорт веществ по ним.

Рис. 19. А - количество миелиновых волокон (по оси ординат) в латеральной части бокового канатика (зона 4) на расстоянии 5 мм каудальнее эпицентра травмы к 60 суткам после КТСМ и введения КОВ. По оси абсцисс диаметр волокон: 1 - более 2 мкм, 2 - от 0,5 до 2 мкм, 3 - менее 0,5 мкм. Серые столбики - контроль (среда Хенкса), белые столбики - опыт. * - р<0,05, **- р<0,005. Б и В - миелиновые волокна (TEM). Увеличение 25000. Длина отрезка 200 нм

К 60 суткам в опытной группе с введением КОВ практически во всех исследованных зонах белого вещества особенно в боковых канатиках на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы, чаще встречаются миелиновые волокна небольшого диаметра с незначительными структурными изменениями в виде редких областей повышенной электронной плотности и незначительных участков расслоения, появления небольших вакуолей в периаксональном пространстве с редкими фрагментами внутренних мембран миелина или островками гомогенного материала (Рис. 20).

Рис. 20. Миелиновые волокна на расстоянии 5 мм от эпицентра травматического повреждения в ростральном направлении на 60 сутки после нанесения травмы и введения КОВ, зона 3. Увеличение 8000. Длина отрезка 1 мкм TEM

Назад | Оглавление | Вперед

Дата публикации (обновления): 12 февраля 2017 г. 15:55

.

	Жизнь после травмы спинного мозга