3.1.2. Влияние трансплантации ККП на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы

Жизнеспособность и миграционный потенциал. В спинном мозге животных с введением ККП, трансфицированных плазмидой pEGFP (Табл. 3 группа 7), специфическое свечение выявлено на расстоянии до 10 мм в ростральном и каудальном направлении от соответствующих точек инъекции. Это свечение наиболее интенсивно на ранних сроках после травмы и введения клеток (2-6 суток), четко прослеживается на более поздних сроках (14-21 сутки) и постепенно затухает к 30 суткам. Меченые ККП присутствуют в сохраненной ткани серого и белого вещества и проникают в патологические полости. Если к первым суткам после трансплантации флюоресцирующие клетки распределены более равномерно и преимущественно в белом веществе, то к 6-м суткам они образуют скопления с интенсивным свечением в вентральной части задних канатиков и в прилегающей к ней дорсальной части серого вещества (Рис. 21 ).

Рис. 21. Свечение EGFP в трансплантированных в область повреждения спинного мозга ККП в задних канатиках на границе с серым веществом (А - 7 суток) и локальное свечение в области заднего кортикоспинального тракта и по ходу задней срединной борозды (Б - 14 суток). Пунктиром показана граница между серым и белым веществом, стрелками - передняя срединная щель. Флюоресцентная микроскопия. Увеличение 25х10

К 7 суткам области с характерным свечением EGFP занимают больший объем ткани, интенсивность свечения возрастает, что может быть следствием увеличения экспрессии EGFP в трансплантированных клетках или увеличения их количества за счет активной пролиферации. К 14 суткам область присутствия EGFP+-клеток значительно сужается (Рис. 23). К этому сроку специфическая флюоресценция EGFP выявлена в компактном скоплении клеток преимущественно в вентральной части задних канатиков на границе с серым веществом.

На рисунке 22 приведена электроннограмма мононуклеарной фракции ККП, использованных в наших экспериментах для модификации.

Рис. 22. Культура клеток мононуклеарной фракции крови пуповины, использованные для трансфекции. Увеличение 4000, длина отрезка 2 мкм TEM

Рис. 23. ККП+pEGFP (контроль). Интенсивность свечения снижается к 30 суткам. Флюоресцентная микроскопия. Увеличение 25х10

Восстановление функции. Оценка восстановления двигательной активности в открытом поле - тестирование методом «ВВВ» показала, что у крыс контрольной группы (DPBS) происходит постепенное частичное самовосстановление произвольных движений с 0,8±0,8 балла на 7-е сутки после КТСМ до 4,2±1 баллов на 30-е сутки эксперимента. У крыс с трансплантацией нативных ККП восстановление произвольных движений систематически достоверно более выражено, чем в контроле: с 4,0 на 7-е сутки до 10,5 баллов к концу эксперимента. Опытные значения показателя «ВВВ» достоверно выше контрольных на всех сроках тестирования (* р<0,05). Средний прирост показателя «ВВВ» при трансплантации нативных ККП составил через 30 суток 6,5, а в контроле - 3,3 (р<0,05) (Рис. 24).

Рис. 24. Результаты теста «ВВВ» при трансплантации нативных ККП. По оси ординат - баллы, по оси абсцисс - сутки после КТСМ и трансплантации. Черные квадратики - опыт, белые кружочки - контроль (DPBS)

Сохранность ткани. Трансплантация в область травмы нативных ККП на 30-е сутки эксперимента приводит к увеличению площади сохранного серого и белого вещества по сравнению с контролем на 52% и 48% на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении и в среднем на 58% в ростральном. На расстоянии 3 мм от эпицентра повреждения достоверных различий по этим показателям не наблюдали (Рис. 25).

Рис. 25. Площадь сохранного белого вещества (по оси ординат) на 30-е сутки после КТСМ и трансплантации нативных ККП. Круглые символы - опыт, треугольные символы - контроль (DPBS). Расстояние от эпицентра травмы в мм слева от 0 - в ростральном направлении, справа - в каудальном. * - р<0,05

Суммарная площадь патологических полостей. На 30-е сутки после КТСМ и трансплантации ККП установлено уменьшение суммарной площади патологических полостей в белом веществе спинного мозга крысы по сравнению с контрольной группой на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы, как в ростральном так и в каудальном направлениях. Наибольшая достоверная разница установлена в ростральном фрагменте. Здесь суммарная площадь патологических полостей в опыте в зонах 1 и 2 в среднем в 2,5 а в зонах 3 и 4 в 4 и 3 раза меньше, чем в контроле (Рис. 26 ). На расстоянии 3 мм от эпицентра травмы достоверных различий по этим показателям не наблюдали.

Рис. 26. Патологические полости на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы, зона 3 (отмечены звездочками). А - контроль (DPBS), Б - опыт (ККП). Увеличение 40х15

Структура патологических полостей при электронномикроскопическом исследовании обнаруживает наличие плотного глиального слоя, образующего рубец на границе между полостью и сохраненной тканью (Рис. 27). Иногда с наружной стороны полости присутствуют макрофаги.

Рис. 27. Электроннограмма патологической полости. Увеличение 12000, длина отрезка 500 нм TEM

Патологические полости на поперечных срезах спинного мозга отличаются от кровеносных сосудов своей неправильной формой и однородным электронно-прозрачным содержимым. Сечение сосудов заполнено эритроцитами (Рис. 28, 29).

Рис. 28, 29. Электроннограммы: патологической полости (28), увеличение 6000, длина отрезка 1 мкм; кровеносного сосуда (29), увеличение 1500, 2500, длина отрезка 2 мкм ТЕМ

Количество миелиновых волокон. Трансплантация нативных ККП человека в зону травмы спинного мозга крысы приводит к увеличению количества сохранных миелиновых волокон как в ростральном, так и в каудальном направлениях. Оболочка сохранных волокон в опыте имеет плотную структуру с четкими слоями миелина (Рис. 30, 31). Наибольшая достоверная разница между контрольным и опытным значениями установлена в боковых канатиках рострального фрагмента. Количество сохранных миелиновых волокон на расстоянии 5 мм в ростральном фрагменте справа в 2,4, слева в 3 раза, на расстоянии 3 мм - в 2 раза в опыте больше, чем в контроле (Рис. 32, 33).

Рис. 30, 31. Структура миелиновых волокон среди коллагеновых волокон рубца в эпицентре травмы при трансплантации ККП. Зоны 3 и 4. Увеличение 40000 и 60000 TEM

Рис. 32. Количество миелиновых волокон в боковых канатиках белого вещества рострального фрагмента спинного мозга крысы на 30-е сутки после КТСМ и трансплантации ККП в зону повреждения (белые столбики). Серые столбики - контроль (DPBS). По оси абсцисс расстояние от эпицентра травмы и зона морфометрии: 1 - 5 мм, зона 3; 2 - 5 мм, зона 4; 3 - 3 мм, зона 3; 4 - 3 мм, зона 4. * р<0,05, ** р<0,005.

Рис. 33. Миелиновые волокна на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении зона 4: А - контроль (DPBS), Б - опыт (ККП); В - интактного животного. Фрагменты белого вещества спинного мозга, окрашенные толуидиновым синим. Увеличение 40х10

Рис. 34 Миелиновые волокна контроль (КТСМ). 5 мм от эпицентра повреждения в ростральном направлении. Длина отрезков 1 мкм и 500 нм

Рис. 35. Электроннограммы миелиновых волокон на расстоянии 5 мм от эпицентра повреждения в ростральном направлении зона 3. Верхние фото - опыт (ККП), нижние фото - контроль (DPBS). Увеличение 6000. Длина отрезков 1 мкм

В каудальном направлении от эпицентра травмы наблюдается та же тенденция, но разница в количестве миелиновых волокон между опытом и контролем меньше, чем в ростральном (Рис. 32). Сохранившиеся волокна в контроле имеют характерное расслоение миелина и разрушенные осевые цилиндры (Рис. 34). В опыте с трансплантацией ККП оболочка выглядит более плотной (Рис.35).

Характеристика миграционных качеств, витальности и способности трансплантируемых стволовых клеток к поддержанию экспрессии плазмидных генов является необходимой основой для последующей оценки результатов применения этих клеток как носителей терапевтических генов. По способности к миграции трансплантированных в спинной мозг КОВ наши данные близки результатам исследования, полученным на модели бокового амиотрофического склероза у трансгенных по супероксиддисмутазе SOD1(G93A) крыс при трансплантации КОВ в область дорсальных канатиков (Li et al. 2011).

Авторы этой работы показали возможность миграции трансплантированных КОВ в спинном мозге реципиента на расстояние 4,2 мм при их выживании в течение более 4 недель. При этом зарегистрировано существенное снижение гибели мотонейронов и стимулирование процесса ремиелинизации. Область повреждения при травме спинного мозга достаточно обширна, поэтому миграционный потенциал трансплантируемых клеток представляется крайне важным для нейрорегенерации. Он особенно значим для сдерживания процесса дегенерации миелиновых волокон и для стимулирования их ремиелинизации на всем протяжении области деструкции, начиная от эпицентра травмы и заканчивая зоной сохраненной ткани с интактными волокнами. В наших экспериментах появление трансплантированных в спинной мозг КОВ на значительном удалении от места инъекции может быть отчасти также связано с их пассивным перемещением вследствие развития отека и напряжения ткани в области травматического повреждения. В отношении КОВ при их трансплантации в спинной мозг допускается возможность подобного неактивного перемещения (Andrews et al. 2007).

Весьма значимым представляются выявленные нами миграционные возможности ККП. Миграционный потенциал ККП, изученный нами в области контузионного повреждения спинного мозга, превышает или находится на уровне типированных гемопоэтических и нейральных стволовых клеток в аналогичных экспериментах (Han et al. 2004, Khalatbary et al. 2007). ККП, трансплантированные в область повреждения, сохраняют жизнеспособность до 30 суток и способны мигрировать на расстояние до 10 мм от места трансплантации в ростральном и каудальном направлении. С учетом того, что в наших экспериментах иммуносупрессия не применялась, а клетки трансплантировали сразу в момент травмы, а не после прохождения пика цитостатического действия провоспалительных цитокинов и клеточных иммунных реакций, отмеченная выше достаточно длительная экспрессия EGFP свидетельствует не только о высокой жизнеспособности трансплантирумых клеток, но и о потенциальной возможности пролонгированной экспрессии терапевтических генов. В целом, ККП и КОВ следует признать сопоставимыми в качестве потенциальных носителей терапевтических генов.

Параметризация двигательной активности позволяет в целом количественно оценить степень восстановления неврологических функций спинного мозга после повреждения. Как показывают литературные источники, восстановление движений может обусловливаться отнюдь не только собственно регенерацией поврежденных клеток спинного мозга, но в значительной мере отражать компенсаторные перестройки уцелевших и вновь сформированных аксональных отростков (Шевелев и др. 2000, Maier et al. 2006, Darian-Smith et al. 2009).

Учет двигательной активности представляется совершенно необходимым для сравнительной оценки способов восстановительной терапии. Так, контрольные группы (с введением среды Хенкса и DPBS) в наших экспериментах показали к 30-му дню весьма умеренные приросты показателя «ВВВ» на уровне 2,5-3,3 балла, отражающие процесс спонтанного восстановления. В то же время в опытных группах с трансплантацией КОВ и ККП средний прирост был почти вдвое больше контрольного, что однозначно свидетельствует о терапевтической действенности трансплантации нативных стволовых клеток. Сравнительно с КОВ, ККП показали достоверно в полтора раза более высокий относительный прирост, что делает терапию на их основе предпочтительной.

Можно предполагать, что сравнение по качеству и интенсивности посттравматических реакций в ткани спинного мозга между контролем и опытом позволит выявить морфологические изменения, обусловленные специфическим влиянием трансплантируемых клеток, одновременно сопоставив их с положительной динамикой восстановления функции.

Наши результаты показывают, что при трансплантации нативные КОВ и ККП способствуют сохранности ткани и сдерживают развитие кавитации, хотя и в разной степени. При сравнении площадей сохранного вещества двух опытных групп 4 и 6 (КОВ и ККП, Табл. 3) на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы выявлено почти двукратное превышение по этому параметру у животных с введением КОВ. Суммарная площадь мелких патологических полостей на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в передних канатиках (зоны 1 и 2) рострального фрагмента в опыте с КОВ в 3,5 и 4 раза, а в боковых канатиках (зоны 3 и 4) - в 5.6 и 6 раз меньше, чем в опыте с ККП. На расстоянии 5 мм от эпицентра травмы наибольшие различия установлены в зонах 1 и 2: суммарная площадь патологических полостей в ростральном фрагменте - в 3.5 раза, в каудальном - в 7 и 13 раз меньше в опыте с трансплантацией КОВ, чем в опыте с трансплантацией ККП.

Более выраженные различия между контролем и опытом на удалении от эпицентра травмы свидетельствуют о том, что трансплантированные стволовые клетки сдерживают процесс вторичной дегенерации, ограничивая его распространение в объеме спинного мозга. Наши наблюдения согласуются с данными о проявлении со стороны КОВ свойств иммунокомпетентных клеток и их способности модулировать выраженность процесса воспаления и вторичного повреждения в области травмы спинного мозга (Gorrie et al. 2010, Kallincik et al. 2010). В отношении клеток крови пуповины человека также установлено, что трансплантация ККП при травме спинного мозга угнетает воспалительную реакцию, оказывает нейротрофическое влияние, стимулирует неоваскуляризацию (Chen et al., 2008) и снижает экспрессию проапоптозных генов (Dasari et al., 2009). Более того, высказывается гипотеза, что в основе терапевтического действия ККП лежит именно подавление нейронального апоптоза. Электронно-микроскопическое исследование показывает, что мелкие патологические полости в большом количестве возникают на месте дегенерирующих миелиновых волокон (Greitz D. et al., 2006, Ek et al., 2012). В последующем может происходить заполнение этих мелких полостей глиальными клетками, что приводит к уменьшению их суммарной площади. Этот процесс протекает более интенсивно в присутствии КОВ, но, по-видимому, не коррелирует ни с абсолютным уровнем, ни с приростом показателя двигательной активности. В то же время по количеству сохранных миелиновых волокон ситуация обратная: через месяц после травмы максимальная разница с контролем зарегистрирована в опытной группе с трансплантацией ККП - примерно в 1,5 раза выше, чем в опытной группе с трансплантацией КОВ.

Назад | Оглавление | Вперед

Дата публикации (обновления): 12 февраля 2017 г. 16:08

.

	Жизнь после травмы спинного мозга