3.2 Влияние на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2

Восстановление функции

ККП, трансфицированные плазмидой pBud-VEGF-FGF2 оказывают выраженное поддерживающее влияние на восстановление двигательной функции при однократной трансплантации как в область латеральной гемисекции, так и в область контузионного повреждения. Первые признаки восстановления двигательной активности наблюдаются в период 6-12 суток после травмы. Они характеризуются слабыми, ясно определяемыми, изолированными движениями в одном или двух суставах задних конечностей. Тестирование животных в открытом поле выявило более раннее и более выраженное восстановление двигательной функции в опытах с трансплантацией ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, чем в контролях (ККП+pEGFP) как при гемисекции, так и при КТСМ (Рис. 36 А, Б).

Прирост показателя «ВВВ» при трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, на сроке 12-30 суток после гемисекции составил в среднем 7,4 балла (р<0,05), после КТСМ 5 баллов (р<0,05). Обращает на себя внимание двухфазный характер зависимости показателя «ВВВ» в интервале от момента проявления первых признаков активности и до окончания эксперимента: начальный крутой рост в течение первых 2-4 дней и последующий более пологий участок. Наклоны соответствующих участков зависимости, характеризующие скорость восстановления двигательной функции, имеют весьма близкие значения в контроле и опыте. Фактически, весь выигрыш в приросте показателя, создаваемый экспрессией терапевтических генов, обусловливается более продолжительным периодом начальной фазы быстрого роста независимо от характера повреждения (Рис. 37).

Рис. 36. Результаты теста «ВВВ» при трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2: А - при гемисекции; Б - при контузионной травме спинного мозга. Опыт - ККП+pBud-VEGF-FGF2, контроль - ККП+pEGFP. По оси ординат - баллы, по оси абсцисс - сутки после травмы и трансплантации. *- р<0,05

Рис. 37. Результаты теста «ВВВ» при трансплантации нативных ККП (белые квадратики) и ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 (черные кружочки). По оси ординат - баллы, по оси абсцисс - сутки после КТСМ и трансплантации. *- р<0,05

Сохранность ткани

В области контузионного повреждения спинного мозга в раннем периоде (7 сутки) после травмы в относительно сохранном сером веществе развивается отек, нервные волокна ростральнее и каудальнее эпицентра травмы дегенерируют, их миелиновая оболочка подвергается деструктивным изменениям. В наибольшей мере повреждение затрагивает серое вещество, в котором наблюдается хроматолиз и гибель нейронов. У животных с введением ККП, трансфицированных плазмидой pEGFP (контроль) к 30-м суткам в области травмы на расстоянии 3 и 5 мм в каудальном и ростральном направлении границы между белым и серым веществом не прослеживаются. На поперечных срезах видна центральная зона полностью дезинтегрированной ткани, имеющей вид обширной полости с рассеянными в ней фрагментами дегенерирующих клеток (Рис. 38).

Величина ее уменьшается по мере удаления от эпицентра травмы: на расстоянии 3мм она составляет 2/3, а на расстоянии 5 мм - до половины всей площади сечения. На периферии среза структура белого вещества более сохранна, признаки деструкции менее выражены. Здесь отмечено обилие микрополостей, разделенных прослойками соединительной ткани с признаками астроглиоза. Явных различий строения эпицентра травмы у животных после введения ККП, трансфицированных плазмидой pEGFP и ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 обнаружено не было.

Рис. 38. Фрагмент спинного мозга крысы на расстоянии 3 мм от эпицентра через 30 суток после трансплантации в область контузионной травмы на уровне T8 ККП, трансфицированных плазмидой pEGFP. Штриховая линия - граница между центральной патологической полостью и зоной относительно сохраненного белого вещества. Увеличение 20х10 и 40х10

В результате латеральной гемисекции спинного мозга так же, как при КТСМ происходит деструкция ткани белого вещества. Естественно, что более сильному разрушению подвергается та сторона, на которой проводилась перерезка. Однако центральная полость, которая формируется в результате травмы имеет более компактные размеры, как в продольном, так и в поперечном направлении в отличие от КТСМ (Рис. 39).

Рис. 39. Фрагмент белого вещества спинного мозга на 30-е сутки после гемисекци: слева - контроль (ККП+pEGFP), справа - опыт (ККП+pBud- VEGF-FGF2). Увеличение 40х10

К 30-м суткам после КТСМ в спинном мозге животных как опытной, так и контрольной группы на расстоянии 3 и 5 мм от эпицентра, формируется единая патологическая полость, которая занимает большую часть серого вещества и частично затрагивает белое (Рис. 40). В полости присутствуют отдельные дегенерирующие клетки и их скопления. К 30-м суткам у

животных опытной группы размеры этой полости существенно меньше, чем в контроле. На поперечных срезах спинного мозга площадь полости в опыте (ККП+pBud-VEGF-FGF2) на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в ростральном направлении уменьшается на 27% (p<0,05), а при том же удалении от эпицентра в каудальном направлении - на 10% (p<0,05), по сравнению с контролем (ККП+pEGFP). При удалении плоскости среза от эпицентра на расстояние 5 мм в ростральном направлении площадь полости в опыте уменьшается на 58% (p<0,05), а в каудальном - на 49% (р<0,05) по сравнению с контролем (ККП+pEGFP).

Рис. 40. Поперечные срезы спинного мозга, окрашенные толуидиновым синим: слева - контроль (ККП+pBud-EGFP), справа - опыт (ККП+pBud- VEGF-FGF2). Пунктирной линией обведена зона деструкции, она же центральная патологическая полость. Увеличение 4х10.

К этому же сроку площадь сохраненного серого вещества на расстоянии 3 мм в ростральном направлении от эпицентра травмы в опыте больше на 66%, а на том же расстоянии в каудальном направлении - на 61%. На расстоянии 5 мм от эпицентра различия между опытной (ККП+pBud- VEGF-FGF2) и контрольной (ККП+pEGFP) группами выражены в меньшей степени, однако по-прежнему положительные сдвиги в ростральном направлении выше, чем в каудальном: на 40% и на 31% (р<0,05), соответственно (Рис. 41 А).

Уменьшение площади деструкции ткани при трансплантации клеток, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2, выявлено также в белом веществе (Рис. 41 Б). К 30 суткам эксперимента на расстоянии 3 мм в ростральном и каудальном направлениях от эпицентра травмы площадь сохраненного белого вещества у животных опытной группы превышает данный показатель у животных контрольной группы (ККП+pEGFP) соответственно на 56% и 63%. На расстоянии 5 мм рострально и каудально от эпицентра травмы площадь сохраненного белого вещества у животных опытной группы увеличивается соответственно на 45 и 43% (р<0,05). Результаты морфометрии свидетельствуют о том, что чем ближе к эпицентру травмы и точкам введения клеток располагается исследуемый участок мозга, тем сильнее проявляется поддерживающий эффект терапевтических генов на сохранность серого и белого вещества. Сравнительно с нативными ККП и КОВ, генно-модифицированные ККП в большей мере способствуют сохранности ткани.

Рис. 41. Площадь (ось ординат, мм ) сохраненного серого (А) и белого (Б) вещества на поперечном срезе спинного мозга крысы на уровне T8 через 30 суток после трансплантации в область контузионной травмы клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pEGFP (пунктирная линия - контроль) и плазмидой pBud-VEGF-FGF2 (сплошная линия - опыт). По оси абсцисс - расстояние от эпицентра травмы в мм слева от 0 - в каудальном, справа - в ростральном направлении. * - р<0,05, ** - р<0,01

Суммарная площадь патологических полостей

К 30-м суткам после нанесения КТСМ и трансплантации трансфицированных ККП в относительно сохраненном белом веществе присутствуют многочисленные мелкие полости (Рис. 43). К этому сроку у животных опытной группы суммарная площадь патологических полостей, сосчитанная на поперечном срезе спинного мозга при удалении от эпицентра на расстояние 3 мм в каудальном направлении, значительно уменьшается (Рис. 42). Так, по сравнению с контрольной группой крыс (ККП+pEGFP), в вентро-медиальной части переднего канатика справа и слева (зоны 1 и 2) она уменьшается в 2,4 и 2,2 раза, а в латеральной части бокового канатика справа и слева (зоны 3 и 4) - в 2,5 и 1,8 раза (р<0,05).

В зонах 1 и 2 справа и слева при том же удалении от эпицентра, но в ростральном направлении, суммарная площадь патологических полостей у животных опытной группы в 2,2 и 2,7, а в зонах 3 и 4 - в 2 раза меньше соответствующего показателя в контроле (ККП+pEGFP) (р<0,05).

На расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в ростральном и каудальном направлениях опытные значения суммарной площади патологических полостей во всех зонах морфометрии в среднем 2,5 раза меньше контрольных (ККП+pEGFP) (р<0,05).

Рис. 42. Суммарная площадь патологических полостей по оси ординат (в мм ) на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении. Белые столбики - контроль (ККП+pEGFP). Серые столбики - опыт (ККП+pBud-VEGF16-FGF2). По оси абсцисс - зоны морфометрии

Рис. 43. Многочисленные патологические полости небольших размеров (обозначены звездочками) и миелиновые волокна (обозначены стрелками) в белом веществе спинного мозга крысы на 30 сутки после КТСМ и трансплантации ККП: А и В трансфицированных плазмидой pEGFP (контроль) (А - зона 3, В - зона 2); Б и Г трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 (опыт) (Б - зона 3, Г - зона 2). Увеличение 40х10

Количество миелиновых волокон

К 30-м суткам после нанесения травмы в белом веществе в участках, забранных на расстоянии 3 и 5 мм от эпицентра травмы, как в ростральном, так и в каудальном направлении, отмечена выраженная деструкция миелиновых волокон (Рис. 44). Она характеризуется глубокими изменениями миелиновой оболочки, расслоением и дезинтеграцией миелина и образованием крупных вакуолей по периферии волокон большого диаметра. При развитии деструктивного процесса эти вакуоли вызывают значительную деформацию осевых цилиндров вплоть до полного их исчезновения.

У животных опытной группы (ККП+pBud-VEGF-FGF2) на 30-е сутки после нанесения травмы в зонах морфометрии наружной части белого вещества на расстоянии 5 мм от эпицентра в ростральном направлении выявлено значительное увеличение количества миелиновых волокон с сохранной структурой (Рис. 45 В, Г). При этом в латеральной части бокового канатика справа (зона 3) количество миелиновых волокон превышало соответствующий показатель в контроле (ККП+pEGFP) на 67% (р<0,05), а слева (зона 4) - на 60% (р<0,05). В вентро-медиальной части переднего канатика это превышение в опытной группе составило 50% (р<0,05) на правой стороне (зона 1) и 47% (р<0,05) на левой (зона 2). В каудальном направлении количество миелиновых волокон увеличивается в латеральной части бокового канатика справа (зона 3) на 57% (р<0,05), а слева (зона 4) на 65% (р<0,05) (Рис. 45 Б); в вентро-медиальной части переднего канатика этот прирост составляет соответственно 57% (р<0,05) (зона 1) и 52% (р<0,05) (зона 2).

Ближе к эпицентру травмы, на расстоянии 3 мм в каудальном и ростральном направлении во всех зонах морфометрии количество миелиновых волокон увеличивается незначительно, в среднем на 20% (р<0,05) (Рис. 45 А, Б).

Рис. 44. Миелиновые волокна в белом веществе спинного мозга крысы на расстоянии 5 мм в ростральном направлении от эпицентра травмы на 30-е сутки после введения клеток крови пуповины человека, трансфицированных плазмидой pEGFP (наверху) и плазмидой pBud-VEGF-FGF2 (внизу). Увеличение на рисунках слева 6000 и справа - 10000. Длина отрезков на рисунках слева 1 мкм, на рисунках справа - 500 нм

Рис. 45. Количество миелиновых волокон (по оси ординат) в зонах морфометрии (по оси абсцисс) при трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2. А - 3 мм рострально, Б - 3 мм каудально, В - 5 мм рострально, Г - 5 мм каудально от эпицентра травмы. Серые столбики - вторая контрольная группа, светлые - вторая опытная группа. * - P<0,05; ** - P<0,01

Рис. 46. Миелиновые волокна при трансплантации в зону травматического повреждения ККП, трансфицированных pBud-VEGF-FGF2. 3 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении, зона 4. Увеличение 6000, длина отрезков 1 мкм

Рис. 47. Эпицентр травмы при трансплантации в зону травматического повреждения ККП+pBud-VEGF-FGF2: наблюдаются единичные мелкие волокна на границе с патологической полостью. Видны поддерживающие клетки и пучки коллагеновых волокон. Увеличение 10000, 2000

На 30 сутки эксперимента в опытной группе (ККП, трансфицированные pBud-VEGF-FGF2) на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы количество миелиновых волокон меньше, чем на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в среднем в 2 раза. При изучении миелиновых волокон в этой зоне с помощью электронного микроскопа выявлено увеличение количества миелиновых волокон диаметром менее 2 мкм, которые мы имеем возможность наблюдать только с помощью электронного микроскопа (Рис. 46, 47, 48, 50).

Рис. 48. Миелиновое волокно диаметром 1.5 мкм в латеральнаой части бокового канатика в пределах фронтальной плоскости, проходящей через центральный канал, левая сторона (зона 3), на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы при введении клеток крови пуповины, трансфицированных pBud- VEGF-FGF2. TEM. Увеличение 40 000, длина отрезка 200 нм

Сравнение по количеству миелиновых волокон опытных групп: с введением КОВ, с введением ККП и с введением ККП, трансфицированных pBud-VEGF-FGF2, показало значительные отличия от контроля. При удалении на 5 мм от эпицентра травмы в ростральном направлении, в зонах 3 и 4 количество миелиновых волокон в материале опытной группы с введением КОВ было на 80% и 68% больше, чем в контрольной группе без введения клеток или жидкостей (Рис. 49). При удалении на 5 мм от эпицентра травмы как в ростральном, так и в каудальном направлении, количество миелиновых волокон в материале опытной группы с введением ККП было в 4 раза больше, чем в контрольной группе без введения клеток или жидкостей. В каудальном направлении в зоне 3 этот показатель был больше на 78%, в зоне 4 - на 73% (Рис. 49).

При трансплантации КОВ и КПП сравнение количества миелиновых волокон в зонах 3 и 4 на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы, как в ростральном, так и в каудальном направлении, достоверных различий не выявило. На 30 сутки после травмы и введения ККП на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в каудальном направлении количество миелиновых волокон достоверно меньше на 34% в зоне 3 и на 20% в зоне 4 по сравнению с соответствующими показателями у животных опытной группы с введением ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2) (Рис. 49). При сравнении по количеству миелиновых волокон в наружных зонах боковых канатиков на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы каждой из трех опытных с четвертой контрольной группой, наибольшее значение данного показателя зарегистрировано при трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 в зоне 3 на 85%, в зоне 4 на 78%.

Рис. 49. Количество миелиновых волокон (по оси ординат) в зонах морфометрии (по оси абсцисс) на расстоянии 5 мм в ростральном направлении на 30 сутки после травмы: серые столбики - при трансплантации клеток обонятельной выстилки человека; белые столбики - при трансплантации клеток крови пуповины человека; заштрихованные столбики - при трансплантации клеток крови пуповины, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2; черные столбики - без введения клеток и жидкостей. * - P<0,05; ** - P<0,01

Рис. 50. Волокна с компактной миелиновой оболочкой, образуемой шванновскими клетками (вверху). Пучки безмиелиновых волокон, окруженные общей мембраной шванновских клеток (внизу). Увеличение 8000. Длина отрезков 1 мкм

Таким образом, по критерию количества миелиновых волокон локальная доставка в область травмы спинного мозга терапевтических генов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) при помощи мононуклеарных ККП оказывается более эффективной, чем доставка нетрансфицированных ККП или КОВ.

В отличие от контрольной группы с трансплантацией ККП, трансфицированных плазмидой pEGFP, в наружной части белого вещества у животных опытной группы с доставкой генов vegf и fgf2 присутствуют волокна с компактной миелиновой оболочкой (Рис. 46, 50). Эти волокна имеют хорошо выраженную базальную мембрану и окружены пучками коллагеновых волокон, что рассматривается как признак миграции в область повреждения шванновских клеток, способных участвовать в ремиелинизации в центральной нервной систеиме (Bunge et al. 1994, Radtke et al. 2004). Рядом с миелиновыми волокнами наблюдается большое количество безмиелиновых волокон, что не характерно для соответствующего по локализации материала, полученного от животных контрольной группы и свидетельствует в пользу позитивного влияния данной комбинации генов на процесс нейрорегенерации.

Назад | Оглавление | Вперед

Дата публикации (обновления): 13 февраля 2017 г. 18:20

.

	Жизнь после травмы спинного мозга