Результаты иммуногистохимических исследований

Совместная реакция с антителами против ядер клеток человека (HNu) и клеточных ядер (DAPI) выявила присутствие иммунопозитивных ККП через 30 суток после травмы в сером (Рис. 51) и белом (Рис. 52) веществе на расстоянии до 1 см от эпицентра травмы в ростральном и каудальном направлениях. Трансплантированные в область повреждения генетически модифицированные ККП способны выживать до 30 суток после травмы, мигрировать на расстояние до 1 см от места трансплантации в каудальном и ростральном направлении и активно экспрессировать фактор VEGF (Рис. 53).

Рис. 51. HNu+-клетки в сером веществе спинного мозга крысы на 30 сутки после КТСМ и трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой pBudVEGF+FGF2 на расстоянии 1 см в каудальном направлении от эпицентра травмы: А - DAPI; Б - HNu; В - совмещенное изображение. Увеличение 40х10

Рис. 52. А - HNu+-клетки в опыте (ККП+pBudVEGF+FGF2); Б - отсутствие реакции в контроле (КТСМ) в области дорсальных канатиков на 30-е сутки эксперимента на расстоянии 1 см в каудальном направлении от эпицентра травмы. Совместная реакция против DAPI и HNu. Увеличение 40х10

Рис. 53. 30 суток после КТСМ и трансплантации ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2. HNu+/VEGF+-клетки в дорсальных рогах спинного мозга крысы на расстоянии 10 мм в каудальном направлении от эпицентра травмы. Синий - DAPI, зеленый - Hnu, красный VEGF. Увеличение 40х10

Осадок конечного продукта иммуногистохимической реакции с антителами против PDGFpR выявлен в клетках преимущественно белого вещества в связи с кровеносными сосудами. Длинные PDGFpR- иммунопозитивные отростки этих периваскулярных клеток ориентированы по ходу кровеносных сосудов, проходящих в радиальном направлении (Рис. 54 и 55 ). Наибольшее количество PDGFpR+-клеток выявлено в наружных зонах белого вещества. Различий в характере распределения и интенсивности осадка иммуногистохимической реакции в материале от животных опытной (ККП+pBud-VEGF-FGF2) и контрольной (ККП+pEGFP) групп выявлено не было. У животных опытной группы в наружных зонах белого вещества на расстоянии 1,5 см от эпицентра травмы количество периваскулярных клеток, экспрессирующих PDGFpR, возрастает в среднем на 30% (Рис. 56).

PDGF-B связываясь через рецепторный вход PDGFpR стимулирует дифференцировку перицитов из предшественников, экспрессирующих PDGFpR, что оказывает поддерживающее влияние на процесс васкуляризации (Betsholtz et al. 2005, Hellstrom et al.2001). Его нарушение показано при дефектах генов PDGF-B и PDGFpR (Lindahl et al. 1997).

Зарегистрированное нами к 30 суткам эксперимента увеличение количества PDGFpR+-клеток (Рис. 54 Б) отражает усиление васкуляризации белого вещества в области травматического повреждения спинного мозга. Этот эффект, по-видимому, является результатом действия VEGF, продуцируемого трансплантируемыми ККП. Полученные результаты свидетельствуют о том, что доставка терапевтических генов vegf и fgf2 при помощи ККП человека стимулирует васкуляризацию ткани спинного мозга.

К 30-м суткам в белом веществе в области повреждения спинного мозга у животных опытной (ККП+pBud-VEGF-FGF2) и контрольной (ККП+pEGFP) групп выявлены редкие Р0+-клетки (Рис. 57), которые по данному фенотипическому признаку могут быть идентифицированы как шванновские клетки. Их количество постепенно уменьшается по мере удаления от эпицентра травмы. На поперечном срезе спинного мозга на расстоянии 15 мм от эпицентра в каудальном направлении в 1 мм2 белого вещества в среднем содержится до 200 Р0+-клеток.

Рис. 54. Экспрессия PDGFbR в зоне 3 белого вещества спинного мозга крысы на расстоянии 10 мм от эпицентра повреждения в ростральном направлении через 14 суток после трансплантации ККП, трансфицированных А - pBud- EGFP (контроль) и Б - pBud-VEGF-FGF2 (опыт). Световая микроскопия. Увеличение 20х10

Рис. 55. PDGFRb+-клетки в белом веществе спинного мозга (ККП+pBud- VEGF-FGF2 ). СВ - серое вещество, БВ - белое вещество, П - патологическая полость, СЩ - срединная щель. Конфокальная микроскопия. Увеличение 20х10, 40х10

Рис. 56. Б. Количество PDGFbR+-клеток (ось ординат) в зонах морфометрии (по оси абсцисс) белого вещества на 30 сутки после операции на расстоянии 15 мм от эпицентра повреждения в ростралном направлении. Белые столбики - опыт (KKn+pBud-VEGF-FGF2), серые столбики - контроль (ККП+pEGFP) (р<0,05)

Таким образом, трансплантация в область КТСМ ККП, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF-FGF2 в большей степени препятствует развитию патологической кавитации, способствует сохранности серого и белого вещества и ремиелинизации, чем трансплатация нативных ККП и клеток, трансфицированных плазмидой с нейтральным геном EGFP. Полученный результат можно объяснить действием экспрессируемых терапевтических трансгенов нейротрофических и ангиогенных факторов на клетки-мишени в повреждённой ткани спинного мозга. Выявленное нами уменьшение патологической кавитации при введении ККП человека, трансфицированных конструкцией pBud-VEGF- FGF2, в спинной мозг крысы согласуется с результатами введения нейральных стволовых клеток, трансфицированных геном vegf при помощи ретровирусного вектора (Howang et al. 2009).

Рис. 57. Экспрессия белка периферического миелина P0 в редких клетках в пределах наружной части левого бокового канатика (зона 3) на поперечном срезе спинного мозга крысы на расстоянии 1,5 см в каудальном направлении от эпицентра на 30-е сутки после нанесения контузионной травмы. Стрелки - иммунопозитивные клетки. Флюоресцентный краситель Atto 647, ядра окрашены DAPI. Конфокальная микроскопия. Увеличение 40х10

При этом в качестве благоприятного для поддержания регенерации фактора авторы исследования отмечают возрастание количества пролиферирующих ^С2+-клеток (Yoo 2007, Sellers 2010), которые рассматриваются как предшественники олигодендроцитов и протоплазматических астроцитов. С другой стороны, рост количества миелиновых волокон может быть следствием увеличения объема тканевого матрикса вследствие уменьшения объема патологических полостей и увеличения области сохраненной ткани в белом веществе.

Назад | Оглавление | Вперед

Дата публикации (обновления): 15 февраля 2017 г. 10:17

.

	Жизнь после травмы спинного мозга