2.2. Гистологические исследования

Через 30 и 60 суток после нанесения травмы животных наркотизировали и транскардиально перфузировали 4% раствором параформальдегида (4°С). Фрагмент спинного мозга длиной 5 см, включающий зону повреждения, забирали вместе с позвонками в параформальдегид. Через 12 часов спинной мозг извлекали из костной ткани и разделяли на 5 равных участков. В экспериментах 1, 2, 4 (Табл.3) все 5 участков спинного мозга фиксировали для морфометрии. В экспериментах 517 (Табл.3) участок мозга, включающий зону повреждения, фиксировали для морфометрии, остальные кусочки клали в 30% раствор сахарозы на фосфатном буфере для иммуногистохимических исследований.

2.2.1 Зоны морфометрии

Морфометрические измерения и подсчет изучаемых параметров проводили на полутонких поперечных срезах, окрашенных толуидиновым синим. При 4-кратном увеличении измеряли площадь сохранного серого и белого вещества на расстоянии 3, 5 мм в экспериментах 5-17 (Табл.1) и до 25 мм в экспериментах 1, 2, 4 (Табл.1) от эпицентра травмы в ростральном и каудальном направлениях. Площадь патологических полостей и количество миелиновых волокон изучали при 20 и 40-кратном увеличении на тех же расстояниях в следующих зонах белого вещества: 1 - вентро-медиальная часть переднего канатика, прилежащая к срединной щели, правая сторона; 2 - то же, левая сторона; 3 - латеральная часть бокового канатика в пределах фронтальной плоскости, проходящей через центральный канал, правая сторона; 4 - то же, левая сторона (Рис. 9).

Рис. 9. Зоны морфометрии (1, 2, 3, 4) в спинном мозге крысы

2.2.2. Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM)

Для ТЕМ исследования участки спинного мозга дофиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде и 1% растворе OsO4 на фосфатном буфере с добавлением сахарозы и заливали в Epon 812 (Fluka). Полутонкие и ультратонкие поперечные срезы изготавливали на ультрамикротоме LKB-III. Полутонкие препараты окрашивали толуидиновым синим. Ультратонкие препараты контрастировали насыщенным водным раствором уранил-ацетата и цитратом свинца и просматривали с помощью трансмиссионного микроскопа JEM-1200.

2.2.3. Иммуногистохимия

Иммуногистохимические исследования проводили на поперечных срезах спинного мозга толщиной 20 мкм, изготовленных на криостате Microm HM 560 (Thermo Scientific) на расстоянии 10 -15 мм в ростральном и каудальном направлении от эпицентра травмы. Методом непрямой стрептавидин-биотин-пероксидазной реакции с LSAB-kit (DAKO) выявляли экспрессию белка S100В (Millipore, 1:200), PDGF0R (Sigma, 1:100) и маркера шванновских клеток транскрипционного фактора Krox20 (Covancе, 1:200). Количество иммунопозитивных клеток подсчитывали на оцифрованных изображениях в тех же 4 зонах белого вещества (Рис. 1). Просмотр препаратов и оцифровку изображений проводили на световом микроскопе Axio Imager A1 (Carl Zeiss).

Иммунофлуоресцентное окрашивание. Для идентификации антигена срезы инкубировали с первичными антителами: против белка S100В (Dako, 1:1200), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) (Santa Cruz, 1:200), транскрипционного фактора Krox20 (Santa Cruz, 1:200), белка периферического миелина P0 (Abcam, 1:100), низкоаффинного рецептора фактора роста нервов р75 (Santa Cruz, 1:100), бета рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGF0R) (Sigma, 1:100), маркера ядер клеток человека HNu (Chemicon, 1:100), VEGF (Sigma, 1:125) и белка теплового шока HSP25 (Stressgen, 1:2000), AQP4 (Sigma, 1:100), в течение одних суток при 4°C. Затем срезы промывали в фосфатно-солевом буфере и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями anti-mouse Alexa 647 (Invitrogen, 1:200), antigoat Alexa 488 (Invitrogen, 1:150), anti-mouse Alexa 488 (Invitrogen, 1:200), anti-rabbit Alexa 555 (Invitrogen, 1:150) в течение 2 часов при комнатной температуре. Для визуализации ядер клеток срезы дополнительно окрашивали в течение 10 минут при комнатной температуре в растворе 4',6- диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 10 мкг/мл фосфатного-солевого буфера, Sigma). Окрашенные срезы заключали в глицерин (Галено Фарм) и изучали при помощи конфокального сканирующего микроскопа LSM 510-Meta (Carl Zeiss).

Для всех иммуногистохимических реакций проводили отрицательные контроли с исключением из инкубационной среды первичных антител или вторичных антител методом их замены на 5% сыворотку осла. Иммуногистохимические исследования проведены в соавторстве с Я.О. Мухамедшиной (КГМУ), С.С. Архиповой, А.Р. Мухитовым (КИББ КазНЦ РАН).

Назад | Оглавление | Вперед

Дата публикации (обновления): 12 февраля 2017 г. 20:20

.

	Жизнь после травмы спинного мозга