3.4. Влияние ККП, трансдуцированных аденовирусом AdV-GDNF, на посттравматическую регенерацию

Восстановление функции

Трансплантация в область травмы спинного мозга крысы клеток крови пуповины (ККП), трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом AdV- GDNF, стимулирует восстановление двигательной функции (Рис. 74).

Рис. 74. Результаты теста «ВВВ» при введении ККП, трансдуцированных AdV-GDNF. По оси ординат - баллы, по оси абсцисс - сутки после КТСМ. Черные квадратики - опыт, белые кружочки - контроль (ККП+AdV- EGFP). * р<0,05

Оценка восстановления произвольных движений в открытом поле - тестирование методом «ВВВ» показала, что у крыс контрольной группы (ККП+AdV-EGFP) происходило постепенное частичное восстановление произвольных движений с 2 балла на 7-е сутки после КТСМ до 9,6 баллов на 30-е сутки эксперимента. У крыс опытной группы (ККП+AdV-GDNF) восстановление произвольных движений было систематически более выраженным, чем в контроле: с 5 на 7-е сутки после КТСМ до 16,5 баллов к концу эксперимента. Средний прирост показателя «ВВВ» в опыте (ККП+AdV-GDNF) составил через 30 суток 10, а в контроле (ККП+AdV-EGFP) - 5 баллов. Достоверные отличия между опытными и контрольными значениями показателей «ВВВ» установлены на сроках 9, 11, 13 сутки эксперимента и составляют не менее 5 баллов (р<0,05).

Сравнение различных вариантов генно-клеточной терапии показывает, что трансплантация в зону повреждения ККП нативных и модифицированных генами vegf, fgf2 и gdnf различным образом сказывается на восстановлении функции спинного мозга (Рис. 75).

Рис. 75. Результаты теста «ВВВ» при введении ККП, трансдуцированных AdV-GDNF (черные кружочки), ККП, трансфицированных pBud-VEGF-FGF2 (белые треугольники) и нативных ККП (белые квадратики) По оси абсцисс - сутки после КТСМ

На 30 сутки после КТСМ показатель «ВВВ» в опытах с трансплантацией модифицированных ККП статистически достоверно выше, чем при трансплантации нативных ККП: на 3 бала при трансфекции (ККП+pBud-VEGF-FGF2) и на 6 баллов при трансдукции (ККП+AdV-GDNF).

Сохранность ткани

На 30 сутки после контузионной травмы и введения непосредственно в зону повреждения ККП, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом AdV-GDNF, наблюдали уменьшение площади участка повреждения и увеличение площади сохранной ткани (Рис. 76 А, Б). На расстоянии 3 см от эпицентра повреждения площадь сохранной ткани возросла на 30 % в ростральном направлении, на 27 % - в каудальном направлении, на расстоянии 5 мм от эпицентра повреждения - на 70 и 65%, соответственно, при сравнении с соответствующим показателем у животных c введением тех же клеток, трансдуцированных AdV-EGFP.

Рис. 76. Фрагменты спинного мозга зоны 1 и 2 на расстоянии 5 мм от эпицентра повреждения на 30-е сутки после КТСМ и трансплантации ККП, трансдуцированных: А - AdV-GDNF (опыт), Б - AdV-EGFP (контроль). В -интактный спинной мозг. Увеличение 20х10

Как видно из рисунка 76 А в сером веществе спинного мозга на 30-е сутки КТСМ и трансплантации ККП, трансдуцированных AdV-GDNF происходит увеличение количества нейронов (показано сплошными стрелками). Нейроны крупные, среди них есть мультиполярные и биполярные. В нейронах хорошо видны ядра и тигроидное вещество. Белое вещество в опыте выглядит целостным, в нем имеются небольшое количество мелких патологических полостей. Однако, в белом веществе в опыте (Рис. 76 А), в отличие от белого вещества интактного мозга (Рис. 76 В), не визуализируются миелиновые волокна в зоне, прилежащей к передней срединной щели (отмечено пунктирными стрелками). При изучении этой области на электронно-микроскопическом уровне наблюдали большое количество клеток с крупными электронноплотными ядрами длинными отростками и вокуолями в цитоплазме (Рис. 77 А и Б).

Рис. 77 А и Б. На 30-е сутки эксперимента с трансплантацией ККП, трансдуцированных AdV-GDNF. Звездочками обозначены ядра предположительно олигодендроцитов. О - отросток, В - вакуоль. Увеличение 8000. Длина отрезка 1 мкм

Суммарная площадь патологических полостей. При трансплантации в зону травматического повреждения ККП, трансдуцированных AdV-GDNF, на 30 сутки после КТСМ наблюдали уменьшение суммарной площади патологических полостей, по сравнению с контролем (ККП+AdV-EGFP) (Рис. 78). На расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в вентро-медиальной части передних канатиков каудального фрагмента справа и слева этот показатель в опыте более чем в 6 раз меньше, чем в контроле (AdV-EGFP) (р <0,05).

В ростральном фрагменте это различие составляет 4,2 раза. В зонах латеральной части боковых канатиков каудального и рострального фрагментов - в среднем в 3 и 4 раза соответственно. Наибольшая разница между опытным и контрольным значениями суммарной площади патологических полостей установлена на расстоянии 5 мм от эпицентра повреждения. Контрольное значение превышало опытное в вентро- медиальной части передних канатиков рострального фрагмента справа и слева более чем в 10 и 8 раз, каудального - в 6 раз, в зонах латеральной части боковых канатиков каудального и латерального фрагментов - в 4 и 5 раз, соответственно (р<0,05).

Количество миелиновых волокон

На 30-е сутки эксперимента с трансплантацией ККП, трансдуцированных AdV-GDNF количество миелиновых волокон достоверно больше, чем в контроле (ККП+AdV-EGFP). В наибольшей степени эта разница проявляется на расстоянии 5 мм от эпицентра повреждения. Так, в опыте количество миелиновых волокон в вентро-медиальной части переднего канатика рострального фрагмента справа и слева на 40% и 56%, каудального фрагмента на 50% и 48% в опыте больше, чем в контроле. В боковых канатиках рострального фрагмента количество миелиновых волокон в опыте на 72% и 80%, каудального - на 65% больше, чем в контроле.

На расстоянии 3 мм от эпицентра травмы в опыте количество миелиновых волокон в вентро-медиальной части переднего канатика справа и слева, как в ростральном, так и в каудальном направлениях, в среднем на 25%, в боковых канатиках в ростральном направлении в среднем на 30% и в каудальном на 26% выше, чем в контроле (Рис. 78).

Рис. 78. Фрагмент белого вещества в зоне латеральной части бокового канатика слева в пределах фронтальной плоскости, проходящей через центральный канал: А и В - ККП+AdV-EGFP (контроль 1), Б и Г - ККП+AdV-GDNF (опыт). Звездочками обозначены патологические полости. Поперечные срезы, окрашенные толуидиновым синим. Увеличение 40х10

Результаты иммуногистохимических исследований

При проведении иммунофлуоресцентных реакций с антителами к а-рецептору тромбоцитарного фактора роста (а-PDGFR) и глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) в опытной и контрольной группах в белом и сером веществе выявлены a-PDGFR+-олигодендроциты и GFAP+-астроциты. На Рис. 79 представлено изображение астроцита при большом увеличении, показывающее полную колокализацию маркеров S100B и GFAP в подтверждение того, что и при использовании только одного маркера GFAP в нашем случае визуализируются именно астроциты.

Рис. 79. ККП+AdV-GDNF (опыт) На расстоянии 1 см в ростральном направлении от эпицентра травмы. S100В (желтый), GFAP (красный), увеличение 63 (иммерсионный объектив), серое вещество (передние рога), 3d визуализация

В опытной группе ККП+AdV-GDNF в зонах подсчёта на расстоянии 0,5 см от эпицентра травмы в каудальном направлении популяция GFAP- положительных астроцитов через месяц после травмы в 2 раза превышала аналогичную в контрольной группе без введения клеток. В контрольной группе с введением ККП+Ad-EGFP численность GFAP+-клеток также была ниже, чем в опыте (Рис. 80, 81, 82, 83 - зоны морфометрии 2 и 3).

Рис. 80. GFAP+-клетки в латеральной части бокового канатика (зона 3) белого вещества спинного мозга крысы на 30-е сутки после КТСМ и трансплантации в зону повреждения ККП, трансдуцированных аденовирусом Ad-EGFP (контроль) на расстоянии 0,5 см от эпицентра травмы в каудальном направлении. GFAP - красный, DAPI - синий. Конфокальная микроскопия. Увеличение 20х10

Рис. 81. GFAP+-клетки в латеральной части бокового канатика (зона 3) белого вещества спинного мозга крысы на 30-е сутки после КТСМ и трансплантации в зону повреждения ККП, трансдуцированных аденовирусом Ad-GDNF (опыт), на расстоянии 0,5 см от эпицентра травмы в каудальном направлении. GFAP - красный, DAPI - синий. Конфокальная микроскопия. Увеличение 20х10

Рис. 82. GFAP+жлетки в вентро-медиальной части переднего канатика (зона 2) белого вещества спинного мозга крысы на 30-е сутки после КТСМ и трансплантации в зону повреждения ККП, трансдуцированных аденовирусом Ad-EGFP (контроль) на расстоянии 0,5 см от эпицентра травмы в каудальном направлении. GFAP - красный, DAPI - синий. Конфокальная микроскопия. Увеличение 20х10

Рис. 83. GFAP+-клетки в вентро-медиальной части переднего канатика (зона 2) белого вещества спинного мозга крысы на 30-е сутки после КТСМ и трансплантации в зону повреждения ККП, трансдуцированных аденовирусом Ad-GDNF (опыт) на расстоянии 0,5 см от эпицентра травмы в каудальном направлении. GFAP - красный, DAPI - синий. Конфокальная микроскопия. Увеличение 20х10

Выявленное нами увеличение количества GFAP+-астроцитов следует рассматривать как позитивный фактор стимулирования нейрорегенерации. Этот вывод основан на известном представлении о роли реактивных астроцитов, которые оказывают антиоксидантное и цитопротекторное действие на нейроны и мелинобразующие олигодендроциты, в том числе путём увеличения экспрессии мембранного транспортёра глутамата и снижения содержания этого возбуждающего нейромедиатора во внеклеточном пространстве (Lepore et al. 2005).

Количество и распределение a-PDGFR+-клеток (Рис. 84) существенно различалось по указанным областям. Обнаружено достоверное увеличение количества a-PDGFR+-клеток во всех фиксированных зонах белого и серого вещества на расстоянии 0,5 см в ростральном направлении от эпицентра повреждения в экспериментальной группе (ККП+AdV-GDNF), по сравнению с контрольной группой без трансплантации клеток (КТСМ).

Рис. 84. Спинной мозг крыс, экспрессия a-PDGFR (красный) в фиксированных зонах серого и белого вещества на расстоянии 0,5 см ростральнее эпицентра травмы: А-Г - контрольная группа животных (КТСМ); Д-З - опытная группа (ККП+AdV-GDNF). VH - вентральные рога; VF - вентро-медиальная область вентральных канатиков; CST - кортикоспинальный тракт в дорсальных канатиках; CC - центральный канал. Иммуногистохимическая реакция с антителами к a-PDGFR. Визуализация ядер: DAPI. Увеличение 40х10

При этом в области VF и CST этот показатель больше в группе ККП+AdV-GDNF по сравнению с группой без трансплантации клеток в 2,8-3 раза, а в зонах СС и VH в 2,2-2,4 раза, соответственно (Рис. 85). Количество a-PDGFR+- олигодендроцитов в опытной группе во всех фиксированных зонах на расстоянии 0,5 см от эпицентра травмы в ростральном направлении было в 23 раза больше, чем в контроле.

Рис. 85. Количество а-РВОБК+-клеток (ось ординат) в фиксированных зонах серого и белого вещества на расстоянии 0,5 см в ростральном направлении от эпицентра повреждения (ось абсцисс), 30 сут. после операции. Белые столбцы - контрольная группа без трансплантации клеток (КТСМ); темные - экспериментальная группа (ККП+AdV-GDNF). VH - вентральные рога; VF - вентро-медиальная область вентральных канатиков; CST - кортикоспинальный тракт в дорсальных канатиках; CC - центральный канал. * р<0,05

a-PDGFR является специфическим маркёром клеток-предшественниц олигодендроцитов (Watzlawik et al. 2013). Наличие a-PDGFR+-клеток в области повреждения имеет большое значение для процесса регенерации, так как свидетельствует о ремиелинизации проводников.

Другим важным участником каскада посттравматических реакций в спинном мозге является белок аквапорин. Разновидность аквапорина AQP4 - это молекулярный водный канал, экспрессируемый синаптическими окончаниями астроцитов в непосредственном контакте с кровеносными сосудами и мягкой мозговой оболочкой. AQP4 играет важную роль в удалении внеклеточной воды в области травмы и снижения проявлений отечности (Kimura et al. 2010).

Экспрессия AQP4 возрастает после КТСМ, однако общее количество белка уже в первые сутки начинает снижаться вследствие массовой гибели астроцитов (Nesic et al. 2006). Известны успешные попытки поддержать экспрессию этого белка путем инъекции сульфорафана, результатом чего явилось уменьшение отека и положительное влияние на восстановление функций (Mao et al. 2011).

Мы исследовали влияние генно-клеточной терапии на экспрессию AQP4 в различных зонах спинного мозга через 30 суток после травмы (Рис. 86). Форма окрашиваемых антителами против AQP4 участков соответствует форме астроцитарных отростков, подтверждая, что экспрессия аквапорина происходит именно в них. Интенсивность и распределение окрашивания как в опыте, так и в контроле сильно различаются по указанным на рисунке 86 зонам.

Рис. 86. Контроль - КТСМ контроль (без введения), 0,5 см рострально от эпицентра травмы, 30 суток. КТСМ+ККП+AdV-GDNF, 30 суток; КТСМ+AdV-GDNF, 30 суток. Зеленым - AQP4, красным - PDGFaR (олигодендроциты), синим - DAPI. А - зона входа задних корешков спинного мозга. Б - вентральные рога. В - вентро-медиальная область вентральных канатиков. Г - кортикоспинальный тракт в дорсальных канатиках. Д - центральный канал. Увеличение 40х10

Значительный рост интенсивности и более равномерная плотность распределения имеют место в вентральных рогах и вентро-медиальной области вентральных канатиков опытной группы, превышая соответствующие характеристики контроля. Можно отметить также сосредоточение AQP4 по ходу кровеносных сосудов. Максимальная плотность окраски достигается на периферии центрального канала, притом, что в контроле она практически отсутствует.

Таким образом, введение гена GDNF в зону травмы как с помощью вирусного агента, так и опосредованно с помощью ККП, трансфицированных вирусом, поддерживает длительную экспрессию AQP4 в белом и сером веществе спинного мозга, что может являться одним из факторов, положительно влияющих на сохранность ткани и функциональное восстановление после травмы спинного мозга.

Назад | Оглавление | Вперед

Дата публикации (обновления): 15 февраля 2017 г. 20:53

.

	Жизнь после травмы спинного мозга